この方法により、IM患者の同じ疾患状態にある異なる免疫細胞の特性評価が可能になり、EBV感染のメカニズムの理解が広がります。手順を実演するのは、私たちの研究室の医師であるリンリン・チャンです。まず、1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブで事前に分離したPBMCを取り、室温で300 Gで10分間回転させます。
上清を捨て、調製した80マイクロリットルのバッファーで細胞を再懸濁します。次に、20マイクロリットルのCD14マイクロビーズを細胞懸濁液に加え、ピペッティングによりよく混合し、氷上でチューブを15分間インキュベートする。次に、1ミリリットルのバッファーを使用してPBMCを洗浄し、室温で10分間300 Gで遠心分離します。
上清全体を廃棄し、500マイクロリットルのバッファーで細胞を再懸濁します。磁気分離の場合は、磁気ビーズセパレーターの上にカラムを置き、3ミリリットルのバッファーでカラムを洗浄してプライミングします。次に、細胞懸濁液をカラムに加えます。
それを通過させ、ラベルのない細胞を15ミリリットルの遠沈管に集めます。3ミリリットルのバッファーでカラムを3回洗浄し、15ミリリットルの遠沈管に廃液全体を回収します。次に、カラムを新しい15ミリリットルの遠沈管に入れ、5ミリリットルのバッファーをカラムに追加します。
プランジャーをカラムにしっかりと押し込み、磁気標識されたセルをチューブに洗い流します。磁気標識した細胞を300 Gで5分間遠心分離します。上清を除去した後、細胞を500マイクロリットルのPBSに再懸濁し、その後のトランスクリプトームシーケンシングのために細胞懸濁液を1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。
回収した非標識細胞を300Gで5分間遠心分離してペレット化し、1.5ミリリットルの微小遠心チューブに100マイクロリットルのPBSで細胞を再懸濁します。次に、2マイクロリットルの各標識抗体を細胞懸濁液に加え、光から保護された氷上で30分間インキュベートします。次に、1.5ミリリットルの微小遠心チューブに100マイクロリットルのPBMC細胞懸濁液を分注し、陰性対照サンプルをCD3、CD4、CD8、およびCD19、単一染色サンプル、CD56、またはCD16染色サンプルとセットした。
次に、対応する蛍光標識抗体を2マイクロリットルずつ各チューブに加え、光から保護された氷上で30分間インキュベートします。インキュベーション後、前述のようにすべての細胞をPBSで洗浄し、500マイクロリットルのPBSに再懸濁します。セル選別システムを開き、電源オンプログラムを実行します。
次に、85マイクロメートルのノズルを取り付け、仕分けストリームを開きます。ソート電圧を4, 500ボルト、周波数を47に設定します。ブレークオフウィンドウでギャップを8に設定し、スイートスポット自動ソートモードをオンにして、液滴振幅値を自動的に決定します。
最後に、サイドストリームウィンドウで液滴遅延を30.31に調整します。前方散布図と側方散布図を使用して、ポリゴンゲートP1を描画し、無傷のリンパ球集団を特定します。次に、前方散乱領域対高さドットプロットを使用して、ポリゴンゲートP2を描画して単一セルを特定し、ダブレットを除外します。
次に、CPCY 5.5エリアドットプロットあたりのCD 19FITCエリア対CD3を使用して、長方形のゲートP3を描画して、CD3陽性T細胞、およびCD19陽性Bセルを選択します。次に、CD4APCCY7領域対CD8PE領域ドットプロットを用いて、矩形ゲートを描画し、CD4、およびCD8陽性T細胞を選択する。最後に、側方散乱領域対CD56またはCD16APC領域ドットプロットを使用して、矩形ゲートを描画して、CD56またはCD16陽性ナチュラルキラー細胞を選択する。
ネガティブコントロールチューブの場合は、取得ダッシュボードでロードをクリックし、ソフトウェアでサイトメーター設定を選択します。インスペクターウィンドウで、パラメータタブをクリックし、前方散乱、側方散乱、およびさまざまな蛍光色素の電圧を調整します。単一の染色チューブをサイトメーターにロードした後、取得ダッシュボードのロードをクリックし、補正タブをクリックして、テキストで説明されているように補正を調整します。
細胞懸濁液を穏やかにボルテックスしてから、チューブをサイトメーターにロードします。200マイクロリットルのFBSを4つの収集フローチューブに加え、チューブをボルテックスします。それらをサイトメーター収集チャンバーに入れます。
異なるタイプのセルを4つのフローチューブに別々に収集します。分離した細胞を300 Gで5分間スピンダウンし、トランスクリプトームシーケンシングのために200マイクロリットルのRNA単離試薬を細胞パレットに加えます。本研究では、異なるサンプルの末梢血由来の免疫細胞亜集団を、免疫磁気ビーズの技術と蛍光活性化細胞選別の技術を組み合わせることによって効率的に選別した。
このプロトコルで重要なのは、細胞ソーティングステップが細胞の生存率を改善するために最適化されていることです。選別された免疫細胞は、健康なエプスタインバーウイルスキャリアおよび非感染サンプルの両方と比較して、感染性単核球症患者におけるCD3、CD8陽性T細胞の割合の増加を示した。対照的に、感染性単核球症の患者では、健康なEBVキャリアおよびEBVに感染していない子供と比較して、CD3、CD4陽性T細胞、およびCD19陽性B細胞の割合の減少が観察されました。
さらに、感染性単核球症の患者では、EBVに感染していない子供と比較して、CD 56またはCD 16陽性のナチュラルキラー細胞の割合の減少が観察されました。.細胞の生存率を維持することは、その後の実験に不可欠です。選別プロセス中に細胞を氷上または冷蔵庫に保管することは、細胞の生存率にとって有益です。
