שיטה זו תאפשר אפיון של תאי חיסון שונים באותם מצבי מחלה של אנשים עם IM, מה שירחיב את הבנתנו לגבי מנגנון ההדבקה ב-EBV. מי שידגים את ההליך יהיה לינלין ז'אנג, רופא מהמעבדה שלנו. כדי להתחיל, קח את PBMCs שבודדו בעבר בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר, וסובב אותו ב 300 G במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
להשליך את supernatant, ולהשעות מחדש את התאים עם 80 microliters של חיץ מוכן. לאחר מכן, להוסיף 20 microliters של CD 14 microads לתרחיף התא, מעורבב היטב על ידי pipetting, ואת דגירה את הצינור במשך 15 דקות על קרח. לאחר מכן לשטוף את PBMCs באמצעות מיליליטר אחד של חיץ צנטריפוגה ב 300 גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
השליכו את כל הסופרנטנט, ושעו מחדש את התאים עם 500 מיקרוליטרים של המאגר. להפרדה מגנטית, הניחו עמודה על מפריד החרוזים המגנטי, והגדילו את העמודה על ידי שטיפתה בשלושה מיליליטר של המאגר. לאחר מכן, הוסף את השעיית התא לעמודה.
אפשרו לו לעבור, ואספו את התאים ללא תווית לתוך צינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר. לשטוף את העמוד שלוש פעמים עם שלושה מיליליטר של המאגר, ולאסוף את כל השפכים בצינור צנטריפוגה 15 מיליליטר. כעת, מקם את העמודה בצינור צנטריפוגה חדש של 15 מיליליטר, והוסף חמישה מיליליטר של חיץ לעמודה.
דחפו את הבוכנה בחוזקה לתוך העמודה כדי לשטוף את התאים המסומנים מגנטית לתוך הצינור. צנטריפוגה של התאים המסומנים מגנטית ב-300 גרם למשך חמש דקות. לאחר הסרת הסופר-נטנט, יש להשעות מחדש את התאים ב-500 מיקרוליטרים של PBS, ולהעביר את השעיית התא לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר לריצוף תעתיק עוקב.
גלולה את התאים שנאספו ללא תווית על ידי צנטריפוגה ב 300 G במשך חמש דקות, ולהשעות מחדש את התאים ב 100 מיקרוליטר של PBS בצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, הוסיפו שני מיקרוליטרים של כל נוגדן מסומן לתרחיף התאים, ודגרו על קרח במשך 30 דקות, מוגנים מפני אור. לאחר מכן, aliquot 100 microliters של מתלה תא PBMC בצינורות microcentrifuge 1.5 מיליליטר כדי להגדיר מדגם בקרה שלילית CD 3, CD 4, CD 8, ו- CD 19, דגימות צביעה בודדות, ותקליטור 56, או CD 16 מכתים דגימה.
לאחר מכן מוסיפים שני מיקרוליטרים של הנוגדן הפלואורסצנטי המתאים לכל צינור, ודוגרים על קרח במשך 30 דקות, מוגנים מפני אור. לאחר הדגירה, יש לשטוף את כל התאים עם PBS כפי שהוכח קודם לכן, ולהשהות מחדש 500 מיקרוליטרים של PBS. פתח את מערכת מיון התאים והפעל את תוכנית ההפעלה.
לאחר מכן, התקן את הזרבובית בגודל 85 מיקרומטר ופתח את זרם המיון. הגדר את מתח המיון ל -4, 500 וולט, ואת התדר ל -47. הגדר את הפער ל- 8 בחלון הפריצה, והפעל את מצב המיון האוטומטי של הנקודה המתוקה כדי לקבוע את ערך משרעת הטיפות באופן אוטומטי.
לבסוף, התאם את השהיית הטיפות ל-30.31 בחלון הזרם הצדדי. באמצעות תרשים נקודת פיזור קדימה לעומת צד, ציירו את שער המצולע P1 כדי לזהות את אוכלוסיית הלימפוציטים השלמה. לאחר מכן, באמצעות אזור פיזור קדימה לעומת תרשים נקודת גובה, ציירו את שער המצולע P2 כדי לזהות את התאים הבודדים, ולא לכלול כפילויות.
לאחר מכן, באמצעות שטח CD 19 FITC לעומת CD 3 לכל תרשים נקודת שטח CPCY 5.5, צייר את השער המלבני P3 כדי לבחור CD 3 תאי T חיוביים, ו- CD 19 תאי B חיוביים. לאחר מכן, באמצעות שטח CD 4 APCCY 7 לעומת CD 8 PE שטח נקודה מתווה נקודה, צייר שער מלבני כדי לבחור CD 4, ותקליטור 8 חיובי T-תאים. לבסוף, באמצעות אזור פיזור צדדי לעומת CD 56 או CD 16 APC שטח נקודה מתווה נקודה, צייר שער מלבני כדי לבחור CD 56, או CD 16 חיובי תאי הרג טבעי.
עבור צינור הבקרה השלילית, לחץ על טען בלוח המחוונים של הרכישה ובחר את הגדרות הציטומטר בתוכנה. בחלון המפקח, לחץ על הכרטיסייה פרמטרים, והתאם את המתחים של פיזור קדימה, פיזור צדדי וצבעים פלואורסצנטיים שונים. לאחר טעינת הצינורות המוכתמים הבודדים לתוך הציטומטר, לחץ על טען בלוח המחוונים של הרכישה ולאחר מכן לחץ על לשונית הפיצוי כדי להתאים את הפיצוי, כמתואר בטקסט.
מערבבים את ההשעיה התא בעדינות, לפני טעינת הצינור לתוך הציטומטר. הוסף 200 מיקרוליטרים של FBS לארבעה צינורות זרימת איסוף, ומערבל את הצינורות. מניחים אותם בתא איסוף הציטומטר.
אסוף את סוגי התאים השונים בנפרד בארבעת צינורות הזרימה. סובבו את התאים המופרדים ב-300 G למשך חמש דקות, והוסיפו 200 מיקרוליטרים של מגיב לבידוד RNA לפלטת התאים לצורך ריצוף שעתוק. במחקר הנוכחי, תת-אוכלוסיות של תאי חיסון מדם היקפי של דגימות שונות מוינו ביעילות על ידי שילוב טכניקות של חרוזים אימונומגנטיים, ומיון תאים מופעל פלואורסצנטי.
חשוב לציין בפרוטוקול זה, שלב מיון התאים עבר אופטימיזציה כדי לשפר את כדאיות התאים. תאי מערכת החיסון הממוינים הראו שיעור מוגבר של תאי T חיוביים מסוג CD 3, CD 8 בחולים עם מונונוקלאוזיס זיהומיות בהשוואה הן לנשאי נגיף אפשטיין-בר הבריאים והן לדגימות לא נגועות. לעומת זאת, ירידה בשיעורים של תאי CD 3, תאי T חיוביים ל-CD 4 ותאי B חיוביים ל-CD 19 נצפתה בחולים עם מונונוקלאוזיס זיהומי בהשוואה לנשאי EBV בריאים, וילדים לא נגועים ב-EBV.
בנוסף, ירידה בשיעורים של CD 56, או CD 16 חיובי תאי הרג טבעיים נצפתה בחולים עם מונונוקלאוזיס זיהומיות בהשוואה לילדים לא נגועים EBV. שמירה על כדאיות התאים חיונית לניסויים הבאים. שמירה על תאים על קרח, או במקרר במהלך תהליך המיון מועילה לכדאיות התאים.
