使用等温滴定量热法测定DNA适配体和四环素的热力学和动力学关联

该协议允许研究人员确定适配体对溶液中游离靶标的结合亲和力，同时提供对结合机制的见解。由于ITC测量由于结合引起的热量变化，因此不需要像SPR等技术那样标记或功能化适配体或功能化。新用户应密切注意所有绑定组件中的匹配缓冲区。

此外，请注意，该技术具有很高的样品要求，对于较大的配体（如蛋白质）可能难以满足。首先，激活透析柱的膜，填充PBS缓冲液，在室温下平衡10分钟，并以5， 000倍G离心15分钟。取出缓冲液并将500微升适配体样品加载到色谱柱中。

以5， 000倍G离心，重复四次以将原始缓冲液换成PBS。使用移液管收集透析的DNA适配体并将其转移到新的1.5毫升管中。收集最后的流通缓冲液以溶解四环素。

确保注射器中实验的缓冲液与参比池中的缓冲液匹配。使用紫外可见光谱仪再次测定适配体浓度。使用最后的交换缓冲液将浓度调节至40微摩尔四环素和2微摩尔适配体。

折叠DNA适配体，在90摄氏度下加热10分钟，在4摄氏度下冷却10分钟，然后回到室温20分钟。使用脱气站或真空泵对折叠的适配体和透析的四环素进行脱气25分钟，以消除溶解的气体。清理并确认机器的清洁度后，使用默认程序并按照制造商的说明使用包含 EDTA 和氯化钙的标准套件测试机器的准确性。

设置运行参数。使用正在运行的程序计算器检查所需的卷。使用此运行参数，使用 ITC 在 ITC 注射器中使用 230 μL 40 μmol 四环素和在 ITC 样品池中使用 485 μL 两微摩尔适配体进行 ITC 测量。

使用移液器将透析的四环素注射器板和折叠的适配体装入样品池中，避免气泡。通过单击软件上的“开始”按钮开始运行ITC仪器。双击打开数据分析软件，开始分析数据。

打开保存的原始数据的路径以了解绑定的趋势。打开“建模”选项卡，并使用不同的绑定模型来查找最适合数据曲线的模型。然后，软件自动计算ITC热图和各种热力学参数，包括焓、熵、自由能、平衡结合常数和化学计量。

收集根据数据和拟合模型信息确定的热力学参数。创建一个报告，包括ITC热图和各种热力学参数的图片。Kim等人选择的适配体与四环素结合，结合亲和力为解离常数1等于13微摩尔，解离常数2等于53纳摩尔。

ITC的拟合模型和化学计量反映了适配体通过与序贯结合模型的2：1结合比与四环素结合。ITC测量确定的位点2的热力学参数表明，焓克服了相对显着的熵损失，驱动了强结合。焓驱动的与熵损失的结合与核酸构象变化有关，这已被报道为RNA与小分子之间的结合行为。

核酸适配体和配体必须在同一缓冲液中。如果通过复叠开发，则应重新折叠适配体，并且必须对样品进行脱气。解决这些考虑因素将确保只有适体-配体相互作用对测量信号有贡献。

由于适配体靶标的大小，适当的后续方法可能是微尺度热泳，以确认测得的溶液中游离结合亲和力。