Este protocolo permite a los investigadores determinar las afinidades de unión de los aptámeros contra objetivos libres en solución, al tiempo que proporciona información sobre el mecanismo de unión. Debido a que ITC mide los cambios en el calor debido a la unión, ni el aptámero ni el ligando necesitan ser etiquetados o funcionalizados, como sería el caso de técnicas como SPR. Los nuevos usuarios deben prestar mucha atención a los búferes coincidentes en todos los componentes de enlace.
Además, tenga en cuenta que la técnica tiene altos requisitos de muestra que pueden ser difíciles de cumplir para ligandos más grandes, como las proteínas. Para comenzar, active la membrana de la columna de diálisis, llene con tampón PBS, equilibre durante 10 minutos a temperatura ambiente y centrifugue a 5, 000 veces G durante 15 minutos. Retire el tampón y cargue 500 microlitros de muestras de aptámeros en la columna.
Centrifugar a 5.000 veces G y repetirlo cuatro veces para cambiar el búfer original por PBS. Recoja el aptámero de ADN dializado con una pipeta y transfiéralo al nuevo tubo de 1,5 mililitros. Recoja el último tampón de flujo para disolver la tetraciclina.
Asegúrese de que el tampón del experimento en la jeringa coincida con el tampón de la celda de referencia. Determine de nuevo la concentración del aptámero utilizando un espectrómetro UV-visible. Utilice el último tampón de intercambio para ajustar la concentración a tetraciclina 40 micromolares y aptámero de dos micromolares.
Doble el aptámero de ADN calentando a 90 grados centígrados durante 10 minutos, enfriando a cuatro grados centígrados durante 10 minutos y luego volviendo a temperatura ambiente durante 20 minutos. Desgasifique el aptámero plegado y la tetraciclina dializada utilizando una estación de desgasificación o una bomba de vacío durante 25 minutos para eliminar los gases disueltos. Después de limpiar y confirmar la limpieza de la máquina, pruebe la precisión de la máquina con un kit estándar que incluya EDTA y cloruro de calcio utilizando el programa predeterminado y siguiendo las instrucciones del fabricante.
Configure los parámetros de ejecución. Compruebe los volúmenes necesarios utilizando una calculadora de programas en ejecución. Con este parámetro de ejecución, realice la medición ITC con 230 microlitros de tetraciclina 40 micromolares en la jeringa ITC y 485 microlitros de aptámero de dos micromolares en la celda de muestra ITC utilizando el ITC.
Cargue las placas de jeringa de tetraciclina dializada y el aptámero plegado en la celda de muestra, evitando burbujas, utilizando una pipeta. Comience a ejecutar el instrumento ITC haciendo clic en el botón Inicio del software. Abra el software de análisis de datos haciendo doble clic para comenzar a analizar los datos.
Abra la ruta de los datos sin procesar guardados para conocer la tendencia de vincular. Abra la pestaña Modelado y utilice diferentes modelos de enlace para encontrar el que mejor se ajuste a la curva de datos. Luego, el software calcula automáticamente el termograma ITC y varios parámetros termodinámicos, incluyendo entalpía, entropía, energía libre, constante de unión de equilibrio y estequiometría.
Recopile los parámetros termodinámicos determinados a partir de los datos y la información del modelo de ajuste. Cree un informe que incluya imágenes del termograma ITC y varios parámetros termodinámicos. El aptámero seleccionado por Kim, et al se une a la tetraciclina con afinidades de unión de la constante de disociación uno es igual a 13 micromolar y la constante de disociación dos es igual a 53 nanomolar.
El modelo de ajuste y la estequiometría de ITC reflejan que el aptámero se une a la tetraciclina a través de una relación de unión de 2:1 con el modelo de unión secuencial. Los parámetros termodinámicos determinados por la medición ITC para el sitio dos indicaron que la entalpía que supera la pérdida entrópica relativamente significativa impulsa la unión fuerte. La unión impulsada por entalpía con pérdida de entropía se relaciona con cambios conformacionales de ácidos nucleicos, que se han reportado como comportamientos de unión entre el ARN y una molécula pequeña.
El aptámero y el ligando deben estar en el mismo tampón. El aptámero debe volver a plegarse si se desarrolla con repliegue, y las muestras deben desgasificarse. Abordar estas consideraciones asegurará que solo las interacciones aptámero-ligando contribuyan a la señal medida.
Debido al tamaño del objetivo del aptámero, un método de seguimiento apropiado podría ser la termoforesis a microescala para confirmar la afinidad de unión medida libre en solución.
