Bu protokol, araştırmacıların aptamers'ın çözelti içinde serbest hedeflere karşı bağlanma afinitelerini belirlemelerini sağlarken, bağlanma mekanizması hakkında fikir verir. ITC, bağlanma nedeniyle ısıdaki değişiklikleri ölçtüğü için, SPR gibi tekniklerde olduğu gibi, ne aptamer ne de ligandın etiketlenmesi veya işlevselleştirilmesi gerekmez. Yeni kullanıcılar, tüm bağlayıcı bileşenler arasında eşleşen arabelleklere çok dikkat etmelidir.
Ek olarak, tekniğin proteinler gibi daha büyük ligandlar için karşılanması zor olabilecek yüksek numune gereksinimlerine sahip olduğunu unutmayın. Başlamak için, diyaliz kolonunun zarını aktive edin, PBS tamponu ile doldurun, oda sıcaklığında 10 dakika dengeleyin ve 15 dakika boyunca 5.000 kez G'de santrifüj yapın. Arabelleği çıkarın ve kolona 500 mikrolitre aptamer numunesi yükleyin.
5.000 kez G'de santrifüj yapın ve orijinal tamponu PBS ile değiştirmek için dört kez tekrarlayın. Diyalizli DNA aptamerini bir pipet kullanarak toplayın ve yeni 1,5 mililitrelik tüpe aktarın. Tetrasiklin'i çözmek için son akış tamponunu toplayın.
Şırıngadaki deney tamponunun referans hücresindeki tamponla eşleştiğinden emin olun. UV-görünür bir spektrometre kullanarak aptamer konsantrasyonunu tekrar belirleyin. Konsantrasyonu 40 mikromolar tetrasiklin ve iki mikromolar aptamer olarak ayarlamak için son değişim tamponunu kullanın.
DNA aptamerini 10 dakika boyunca 90 santigrat derecede ısıtarak, 10 dakika boyunca dört santigrat derecede soğutarak ve ardından 20 dakika boyunca oda sıcaklığına geri döndürerek katlayın. Çözünmüş gazları ortadan kaldırmak için katlanmış aptamer ve diyalize tetrasiklin gazını bir gaz giderme istasyonu veya vakum pompası kullanarak 25 dakika boyunca boşaltın. Makinenin temizliğini temizledikten ve onayladıktan sonra, varsayılan programı kullanarak ve üreticinin talimatlarını izleyerek EDTA ve kalsiyum klorür içeren standart bir kit ile makinenin doğruluğunu test edin.
Çalışan parametreleri ayarlayın. Çalışan bir program hesaplayıcısı kullanarak gerekli birimleri kontrol edin. Bu çalışan parametre ile, ITC şırıngasında 230 mikrolitre 40 mikromolar tetrasiklin ve ITC örnek hücresinde 485 mikrolitre iki mikromolar aptamer ile ITC ölçümü yapın.
Diyalize tetrasiklin şırınga plakalarını ve katlanmış aptamer'i bir pipet kullanarak kabarcıklardan kaçınarak numune hücresine yükleyin. Yazılımdaki Başlat düğmesine tıklayarak ITC cihazını çalıştırmaya başlayın. Verileri analiz etmeye başlamak için çift tıklayarak veri analizi yazılımını açın.
Bağlama eğilimini bilmek için kaydedilen ham verilerin yolunu açın. Modelleme sekmesini açın ve veri eğrisine en uygun olanı bulmak için farklı bağlama modelleri kullanın. Daha sonra, yazılım ITC termogramını ve entalpi, entropi, serbest enerji, denge bağlama sabiti ve stokiyometri dahil olmak üzere çeşitli termodinamik parametreleri otomatik olarak hesaplar.
Verilerden belirlenen termodinamik parametreleri ve montaj modeli bilgilerini toplar. ITC termogramının resimlerini ve çeşitli termodinamik parametreleri içeren bir rapor oluşturun. Kim ve arkadaşları tarafından seçilen aptamer, tetrasiklin ile ayrışma sabitinin bağlanma afiniteleri ile bağlanır ve ayrışma sabiti iki eşittir 53 nanomolar.
ITC'nin montaj modeli ve stokiyometrisi, aptamerin tetrasiklin ile sıralı bağlama modeli ile 2: 1 bağlama oranı ile bağlandığını yansıtır. İkinci bölge için ITC ölçümü ile belirlenen termodinamik parametreler, nispeten önemli entropik kaybın üstesinden gelen entalpinin güçlü bağlanmayı yönlendirdiğini göstermiştir. Entropi kaybı ile entalpi güdümlü bağlanma, RNA ve küçük bir molekül arasında bağlanma davranışları olarak bildirilen nükleik asit konformasyonel değişiklikleri ile ilgilidir.
Aptamer ve ligand aynı tamponda olmalıdır. Aptamer, yeniden katlanarak geliştirilirse yeniden katlanmalı ve numuneler gazdan arındırılmalıdır. Bu hususları ele almak, ölçülen sinyale yalnızca aptamer-ligand etkileşimlerinin katkıda bulunmasını sağlayacaktır.
aptamer hedefinin büyüklüğü nedeniyle, uygun bir takip yöntemi, çözeltide ölçülen bağlanma afinitesini serbest olarak doğrulamak için mikro ölçekli termoforez olabilir.
