Este protocolo permite que os pesquisadores determinem as afinidades de ligação dos aptâmeros contra alvos livres de solução, ao mesmo tempo em que fornecem informações sobre o mecanismo de ligação. Como o ITC mede as mudanças no calor devido à ligação, nem o aptâmero nem o ligante precisam ser rotulados ou funcionalizados, como seria o caso de técnicas como o SPR. Novos usuários devem prestar muita atenção aos buffers correspondentes em todos os componentes de ligação.
Além disso, esteja ciente de que a técnica tem altos requisitos de amostra que podem ser difíceis de atender para ligantes maiores, como proteínas. Para começar, ative a membrana da coluna de diálise, preencha com tampão PBS, equilibre-se por 10 minutos à temperatura ambiente e centrifuga-se a 5.000 vezes G por 15 minutos. Remova o tampão e carregue 500 microlitros de amostras de aptâmero na coluna.
Centrifugar a 5.000 vezes G e repeti-lo quatro vezes para trocar o buffer original por PBS. Colete o aptâmero de DNA dialisado usando uma pipeta e transfira-o para o novo tubo de 1,5 mililitro. Recolha o último tampão de fluxo para dissolver a tetraciclina.
Certifique-se de que o buffer para o experimento na seringa corresponde ao buffer na célula de referência. Determine a concentração de aptâmero novamente usando um espectrômetro UV-visível. Use o último tampão de troca para ajustar a concentração para tetraciclina de 40 micromolares e aptâmero de dois micromolares.
Dobre o aptâmero de DNA aquecendo a 90 graus Celsius por 10 minutos, resfriando a quatro graus Celsius por 10 minutos e, em seguida, retornando à temperatura ambiente por 20 minutos. Desgaseifique o aptâmero dobrado e a tetraciclina dialisada usando uma estação de desgaseificação ou bomba de vácuo por 25 minutos para eliminar os gases dissolvidos. Depois de limpar e confirmar a limpeza da máquina, teste a precisão da máquina com um kit padrão que inclui EDTA e cloreto de cálcio usando o programa padrão e seguindo as instruções do fabricante.
Configure os parâmetros em execução. Verifique os volumes necessários usando uma calculadora de programa em execução. Com este parâmetro de execução, realize a medição de ITC com 230 microlitros de tetraciclina de 40 micromolares na seringa ITC e 485 microlitros de aptâmero de dois micromolares na célula de amostra de ITC usando o ITC.
Carregue as placas de seringa de tetraciclina dialisada e o aptâmero dobrado na célula da amostra, evitando bolhas, utilizando uma pipeta. Comece a executar o instrumento ITC clicando no botão Iniciar no software. Abra o software de análise de dados clicando duas vezes para começar a analisar os dados.
Abra o caminho dos dados brutos salvos para saber a tendência de vinculação. Abra a guia Modelagem e use modelos de vinculação diferentes para encontrar o melhor ajuste para a curva de dados. Em seguida, o software calcula automaticamente o termograma ITC e vários parâmetros termodinâmicos, incluindo entalpia, entropia, energia livre, constante de ligação de equilíbrio e estequiometria.
Colete os parâmetros termodinâmicos determinados a partir dos dados e informações do modelo de ajuste. Crie um relatório incluindo imagens do termograma ITC e vários parâmetros termodinâmicos. O aptâmero selecionado por Kim, et al liga-se à tetraciclina com afinidades de ligação de constante de dissociação uma igual a 13 micromolares e constante de dissociação duas igual a 53 nanomolares.
O modelo de ajuste e a estequiometria do ITC refletem que o aptâmero se liga à tetraciclina através de uma relação de ligação de 2:1 com o modelo de ligação sequencial. Os parâmetros termodinâmicos determinados pela medição ITC para o local dois indicaram que a superação da entalpia relativamente significativa impulsiona a forte ligação. A ligação impulsionada pela entalpia com perda de entropia refere-se a alterações conformacionais do ácido nucleico, que foram relatadas como comportamentos de ligação entre o RNA e uma pequena molécula.
O aptâmero e o ligante devem estar no mesmo tampão. O aptâmero deve ser redobrado se desenvolvido com redobramento, e as amostras devem ser desgaseificadas. Abordar essas considerações garantirá que apenas as interações aptâmero-ligante contribuam para o sinal medido.
Devido ao tamanho do alvo do aptâmero, um método de acompanhamento apropriado poderia ser a termoforese em microescala para confirmar a afinidade de ligação medida livre em solução.
