在反应中使用酶作为催化剂可以减少反应所需的能量量，并减少有毒副产品。然而，酶在工业中的使用是有限的，因为酶不稳定，而且可能很贵。该协议可以减少确定条件是否有害于酶活性的时间，或者对酶的修改是否增加了其稳定性。
这种技术的主要优点是，它需要比传统的酶稳定性测定更少的工时。此外，该协议可以与广泛的酶一起使用，因为它可以与释放或吸收热量的任何反应一起使用。首先，准备0.1摩尔醋酸钠缓冲液。
在1000毫升分级烧杯中测量800毫升蒸馏水。然后，重8.2克无水醋酸钠，并添加到烧杯。将烧杯放在搅拌盘上。
将搅拌棒放入烧杯中，然后打开搅拌板搅拌，直到完全溶解。当无水醋酸钠完全溶解时，使用校准的pH米测量溶液的pH值。使用移液器添加 1 摩尔盐酸或氢氧化钠，以在 4.6 时获得所需的 pH 值。
将蒸馏水加入烧杯，直到总体积达到1000毫升。为了准备酶溶液，在15毫升分级圆柱中，测量8毫升的0.1摩尔醋酸钠缓冲液。然后，将缓冲液加入含有酶的15毫升圆锥管中，然后用力摇动，直到酶溶解。
添加更多缓冲液，直到总体积达到 10 毫升。将酶溶液储存在4摄氏度，直到使用。要准备基板溶液，请称重基板，并放入 100 毫升玻璃烧杯中。
使用分级油缸测量缓冲溶液的 20 毫升，然后将其添加到玻璃杯中。将烧杯放在搅拌板上，将磁搅拌棒放入烧杯中。打开热量，并相应地调整搅拌速度。
允许搅拌继续，直到基板溶解。将基板溶液倒入15毫升圆锥管中，加入先前准备的醋酸钠缓冲液，直到总体积为45毫升。摇动管子混合。
将基板溶液存放在室温下，直到使用。在计算机上，打开 ITC 运行并单击设置。单击搅拌速率，并设置为 350 rpm。
检查注射器尺寸为 50 微升。将温度设置为 55 摄氏度，然后按更新。请等待至少一小时，然后继续操作，以便 ITC 仪器根据需要加热或冷却。
在加载酶之前，确保参考细胞中装有 350 微升蒸馏水。要清洁样品细胞，请用 500 微升 2% 清洁溶液填充装料注射器。小心地将针头插入样品细胞，填充细胞，然后使用同一注射器慢慢取出液体。
将液体放入烧杯中。使用 2% 的清洁溶液重复此步骤两次，用 70% 乙醇重复三次，然后用蒸馏水洗涤十次。样品细胞清洁后，用450微升酶溶液填充装料注射器。
小心地将针头一直插入样品单元的底部，然后缓慢地将柱塞向下按至 100 微升管，以防止形成气泡。然后，用蒸馏水将50微升滴定注射器用蒸馏水洗三次，将针尖放入水中慢慢将水放入注射器中，然后将水放入废物容器中。用基底溶液冲洗三次，去除残留水。
之后，将溶液向上绘制，直到注射器充满没有任何气泡，使滴定注射器充满基底溶液。当注射器仍在基底溶液中时，取出柱塞，并允许大约 2 微升空气进入注射器的顶部，并重新插入柱塞。拆下 ITC 的毛刺手柄，将注射器放在毛刺手柄内，拧紧直到拧紧。
用无绒组织擦拭滴定注射器的尖端，然后小心地将毛刺手柄放入 ITC 仪器中，然后锁定到位。对于实验设置，选择增量滴定。单击插入以设置注射。
将注射间隔调整为 5，400 秒，注射量调整为 4 微升，注射次数调整为 4 次。按"确定"确认设置。在平衡框中，选择自动均衡和大预期热量。
将初始基线设置为 300 秒。要开始运行，请单击搅拌速率旁边的开始符号，然后单击位于扳手符号旁边的"开始"。保存文件，并允许仪器运行。
要分析数据，请打开 Nano 分析中的文件。单击数据，然后选择数据列。选择所有数据，复制，然后将数据粘贴到 Microsoft Excel 中。
通过添加 300 秒所需的值使其为 0 来调整 0 基线。将此校正应用于整个热速率值列。然后，根据点分期间值发生的时间绘制最小值或最大值的图形。
在此协议中，ITC 在 55 摄氏度、45 摄氏度、35 摄氏度和 25 摄氏度的 pH 4.6 缓冲液中连续将乳糖酶注射到乳糖酶溶液中，显示了乳糖酶活性的跟踪。在55摄氏度下对混合的热量没有酶控制。对于每次注射酶，有混合的初始放热热，随后，乳糖催化内热水解发生，直到反应完成，热速率返回到基线。
每次注射后，内热峰值最小值，由于酶活性降低，比之前注射少一点。正如预期的那样，每次注射的酶稳定性会随着温度的升高而降低。控制实验显示，由于四次注射后稀释，25摄氏度的乳糖酶活性酶活性降低了8%。
考虑到第四次注射显示测定结果减少73%，酶活性的实际损失因此为65%。因此，每次注射导致的乳糖酶的稀释，对酶活性的影响相对较小，为11%。使酶和基底溶液的缓冲液尽可能紧密地匹配，这一点很重要。
pH值或浓度不匹配会导致更大的混合热量，从而掩盖反应热量。你可以应用这个协议来研究酶，通过测量反应过程中释放或吸收的热量速率来确定其稳定性。
