这种荧光显微镜方法以自动化方式定量肠上皮细胞内的沙门氏菌表型，允许以可扩展的分辨率研究大量菌株上的沙门氏菌。我们的方法具有定量、高通量和自动化的优势，同时依赖于区域和单细胞分析。细胞内行为是许多细菌宿主-病原体相互作用的核心。
我们的方法可以很容易地适应沙门氏菌以外的细菌病原体，有助于了解它们的发病机制。采集图像后，通过打开采集进行单细胞分析。图像J中的czi文件。
通过单击图像并选择"颜色"，然后选择"拆分通道"来拆分通道。对于细胞分割，请在 C1 采集标题窗口中选择 Z 平面图像。选择 C1 采集标题窗口，然后单击图像，然后单击副本。
然后，写下所选 Z 平面的编号。在标题框中写入 C1Zplane，取消选中复制堆栈，然后单击确定以仅复制选定的 Z 平面图像。将打开一个名为 C1Zplane 的窗口，显示选定的 Z 平面图像。
现在，通过选择"处理"并单击"增强对比度"来增强获得的C1Z平面图像的图像对比度。调整饱和像素，选中归一化，然后单击确定以应用对比度增强技术以获得对比度归一化 C1Zplane 图像。转到过程并单击查找千里马以在对比归一化 C1Zplane 图像中分割上皮细胞。
然后，要仅将一个最大值点归因于每个上皮细胞，请标记预览点选择并设置噪声容限。要获取 C1Zplane 分割图像（一个新的二进制掩码状图像，该图像显示每个标记的最大值点的每个分割粒子），标记排除边缘最大值，选择分割粒子作为输出类型，然后单击确定。接下来，在 C1Zplane 分割图像中创建分割单元格的蒙版。单击"分析"，然后单击"分析粒子"，然后选择"在边缘上显示蒙版"和"排除"选项。
设置大小间隔，单击确定，获取C1Z平面分段二进制掩码的掩码。单击查阅表格，然后在工具栏中选择反转查阅表格。若要阈值对比度归一化 C1Zplane 图像，请转到图像，选择"调整"，选择"阈值"，然后检查深色背景。
将自动阈值设置设置为默认值，然后选择红色选项。调整最小截止值，直到单元格完全显示为红色，留下深色背景。单击"应用"将对比度归一化的 C1Zplane 图像转换为单元格为白色，背景为黑色的二进制图像。
此外，要校正C1Zplane分段二进制掩码的掩码中的细胞分割，请选择处理并单击图像计算器。然后，选择分割为图像一的C1Z平面的掩模，在下拉列表中选择操作AND，并选择阈值对比度归一化C1Z平面作为图像二。单击确定，ImageJ将自动将输出图像命名为C1Z平面分割掩码的结果。
要将 C1Zplane 的每个分割像元标记为感兴趣区域，请单击分析，然后单击分析粒子。如前所述调整大小，然后选择"不显示任何内容"选项。通过选中添加到管理器将所有粒子添加到 ROI 管理器工具。
另外，检查 排除 在边缘并单击 确定.将ROI数据另存为ROI-cell-Acquisition title。通过单击"更多"并选择"保存"来快速浏览"ROI 管理器"菜单。完成细胞分割后，在 C2 采集标题窗口上工作以分析空泡沙门氏菌。
首先，转到 过程，单击 图像计算器，选择 C2 采集标题作为图像一，然后选择操作 减去 在下拉列表中。然后，选择 C3 采集标题作为图像二，选中创建新窗口，然后单击确定。通过在"处理堆栈"窗口中单击"是"，对整个 Z 堆栈应用减法。通过单击"图像"菜单并选择"复制"来复制 C2 采集标题窗口的结果。
然后检查重复堆栈并按OK获取C2获取标题一窗口的结果。将高斯模糊应用于 C2 采集标题的结果，方法是转到"过程"，单击"过滤器"，然后选择"高斯模糊"。将 Sigma 值保留为 2 或对其进行自定义。
单击"确定"，然后在"处理堆栈"窗口中单击"是"，将高斯模糊应用于整个 Z 堆栈。通过单击"处理"并选择图像计算器，将 C2 采集标题 1 的高斯滤波结果减去 C2 采集标题的结果。现在选择C2采集标题的结果作为图像一，选择操作减去下拉列表中，选择C2采集标题一的结果作为图像二，然后单击OK。通过在"处理堆栈"窗口中单击"是"，对整个 Z 堆栈应用减法，以获取由 ImageJ 自动命名为 C2 采集标题结果结果的窗口。
要将沙门氏菌与 C2 采集结果的背景分开标题，请单击图像，选择调整，然后单击阈值。然后，检查深色背景并将自动阈值设置为Otsu。调整最小截止值，直到沙门氏菌完全显示为红色，留下深色背景。
单击"应用"，将打开一个名为"转换为二进制"的窗口。检查黑色背景，然后单击确定。选择中间Z平面对应于细胞内沙门氏菌焦点平面的结果C2获取标题二元窗口的结果。单击图像，然后单击"堆栈"，然后选择"设置切片"。
现在写下所选 Z 平面的编号，然后单击"确定"。接下来，通过单击分析并选择设置测量来设置要记录的每个 ROI 的测量值。然后，检查对应于每个ROI的总面积的面积。要记录每个 ROI 的阈值像素所占用的面积分数，请选中面积分数和限制为阈值。
检查显示标签，使用图像标题、通道、Z 平面和 X/Y 坐标标记每个 ROI。使用所选的细胞内沙门氏菌Z平面记录每个细胞的标签，面积和沙门氏菌占据的面积百分比。打开 ROI-细胞获取标题。
zip 文件，方法是单击"文件"菜单并选择"打开"。然后，单击ROI管理器菜单中的度量。输出是一个报告所选测量值的表格。
最后，通过选择文件并单击结果窗口中的另存为来保存结果表。在上皮细胞内可视化沙门氏菌的细胞侵袭、液泡负荷和胞质超复制。面积分析显示，与两种沙门氏菌德比菌株相比，鼠伤寒沙门氏菌的感染率显着更高，证明了面积分析在检测沙门氏菌菌株定植上皮细胞的能力差异方面的功效。
与野生型沙门氏菌相比，沙门氏菌德比sipA缺失突变株显示出降低的超复制率，与sipA在诱导超复制中的作用一致。鼠伤寒沙门氏菌和野生型沙门氏菌之间未观察到超复制差异。单细胞分析显示，与鼠伤寒沙门氏菌相比，沙门氏菌德比菌株中感染细胞的百分比没有显着差异。
否则，沙门氏菌德比菌株产生的平均空泡负荷明显低于鼠伤寒沙门氏菌。鼠伤寒沙门氏菌和野生型沙门氏菌之间没有差异，而沙门氏菌德比sipA的超复制率显着降低，与面积分析结果一致。沙门氏菌包括几种具有不同毒力的血清型。
通过这种快速和自动化的方法研究大量菌株，有助于了解这种病原体的真正毒力潜力。
