Этот метод флуоресцентной микроскопии количественно определяет фенотипы сальмонеллы внутри эпителиальных клеток кишечника автоматизированным способом, что позволяет изучать сальмонеллу на большом количестве штаммов с масштабируемым разрешением. Наше преимущество заключается в том, что он является количественным, высокопроизводительным и автоматизированным одновременно, полагаясь как на площадной, так и на одноклеточный анализ. Внутриклеточное поведение занимает центральное место во взаимодействии хозяина и патогена многих бактерий.
Наш метод может быть легко адаптирован к бактериальным патогенам, отличным от сальмонеллы, способствуя пониманию их патогенеза. После получения изображений выполните одноклеточный анализ, открыв приобретение. czi файл в ImageJ.
Разделите каналы, щелкнув изображение и выбрав «Цвет», а затем «Разделенные каналы». Для сегментации ячеек выберите изображение плоскости Z в окне получения C1. Выберите окно получения C1 и нажмите на изображение, за которым следует дубликат.
Затем запишите номер выбранной плоскости Z. Запишите C1Zplane в поле заголовка, снимите флажок Дублировать стек и нажмите кнопку ОК, чтобы дублировать только выбранное изображение плоскости Z. Откроется окно C1Zplane, показывающее выбранное изображение плоскости Z.
Теперь увеличьте контрастность полученного изображения C1Zplane, выбрав Процесс и щелкнув Повысить контрастность. Отрегулируйте насыщенные пиксели, установите флажок Нормализовать и нажмите кнопку ОК, чтобы применить метод повышения контрастности для получения контрастно-нормализованного изображения C1Zplane. Перейдите в Процесс и нажмите кнопку Найти максимумы, чтобы сегментировать эпителиальные клетки на контрастном нормированном изображении C1Zplane.
Затем, чтобы присвоить каждой эпителиальной ячейке только одну точку максимума, пометьте выделение точки предварительного просмотра и установите допуск шума. Чтобы получить сегментированное изображение плоскости C1Z, новое двоичное маскоподобное изображение, показывающее каждую сегментированную частицу на точку максимума, помеченной, пометьте максимы края Exclude, выберите сегментированные частицы в качестве типа Output и нажмите кнопку OK. Затем создайте маску сегментированных ячеек в сегментированном изображении C1Zplane. Нажмите «Анализировать», затем «Анализировать частицы», затем выберите параметры «Показать маски» и «Исключить» по краям.
Установите интервал размеров и нажмите кнопку ОК, чтобы получить маску сегментированной двоичной маски C1Zplane. Щелкните таблицу подстановки и выберите Инвертировать таблицу подстановки на панели инструментов. Чтобы установить пороговое значение для изображения C1Zplane с нормализованным контрастом, перейдите к изображению, выберите «Настроить», выберите «Пороговое значение» и проверьте темный фон.
Установите для параметра автоматического порога значение по умолчанию и выберите красный параметр. Отрегулируйте минимальное значение отсечки до тех пор, пока ячейки не станут полностью красными, оставив темный фон. Нажмите кнопку Применить, чтобы преобразовать нормализованное контрастное изображение C1Zplane в двоичное изображение с белыми ячейками и черным фоном.
Далее, чтобы исправить сегментацию ячеек в маске сегментированной двоичной маски C1Zplane, выберите Обработать и нажмите на Калькулятор изображений. Затем выберите маску C1Zplane, сегментированную как первое изображение, выберите операцию AND в раскрывающемся списке и выберите пороговую контрастную нормализованную C1Zplane в качестве второго изображения. Нажмите OK, и ImageJ автоматически назовет выходное изображение как результаты Mask of C1Zplane Segmented.
Чтобы пометить каждую сегментированную ячейку плоскости C1Z как область интереса, нажмите «Анализировать», а затем «Анализировать частицы». Отрегулируйте размер, как показано ранее, и выберите опцию Показать ничего. Добавьте все частицы в инструмент менеджера ROI, установив флажок Добавить в менеджер.
Кроме того, установите флажок Исключить по краям и нажмите кнопку ОК. Сохраните данные ROI как roi-cells-acquisitiontitle. Zip через меню менеджера ROI, нажав Кнопку "Еще" и выбрав "Сохранить". После завершения сегментации клеток поработайте над окном получения титула C2 для анализа вакуолярной сальмонеллы.
Сначала перейдите в Процесс, нажмите на Калькулятор изображений, выберите заголовок получения C2 в качестве первого изображения и выберите операцию Вычитать в раскрывающемся списке. Затем выберите заголовок получения C3 в качестве второго изображения, установите флажок Создать новое окно и нажмите кнопку ОК. Примените вычитание ко всему стеку Z, нажав кнопку Да в окне Стек процессов. Продублируйте результаты титульного окна получения C2, щелкнув в меню Изображение и выбрав Дублировать.
Затем проверьте стек дубликатов и нажмите OK, чтобы получить результаты получения C2 титула в одном окне. Примените размытие Гаусса к результатам получения заголовка C2 в одном окне, перейдя в Процесс, щелкнув Фильтр и выбрав размытие Гаусса. Оставьте значение Sigma равным двум или настройте его.
Нажмите OK и примените размытие Гаусса ко всему стеку Z, нажав кнопку Да в окне стека процессов. Вычтите отфильтрованные по Гауссу результаты приобретения C2 к результатам получения титула C2, щелкнув Процесс и выбрав Калькулятор изображений. Теперь выберите результаты получения C2 в качестве первого изображения, выберите операцию Вычитать в раскрывающемся списке, выберите результаты получения C2 title one как изображение два и нажмите OK. Примените вычитание ко всему стеку Z, щелкнув Да в окне Стек процессов, чтобы получить окно, автоматически названное ImageJ как результаты получения заголовка C2.
Чтобы отделить сальмонеллы от фона результатов получения заголовка C2, щелкните изображение, выберите Настроить и щелкните Пороговое значение. Затем проверьте темный фон и установите для автоматического порога значение Otsu. Отрегулируйте минимальное значение отсечения до тех пор, пока сальмонеллы не станут полностью красными, оставив темный фон.
Нажмите «Применить», и откроется окно с именем «Конвертировать в двоичный файл». Проверьте черный фон и нажмите OK. Выберите среднюю Z-плоскость, соответствующую плоскости фокусировки внутриклеточных сальмонелл в результатах двоичного окна получения титула С2. Щелкните изображение, а затем Stacks и выберите Set Slice (Задать фрагмент).
Теперь запишите номер выбранной плоскости Z и нажмите OK. Затем настройте измерения для записи для каждой рентабельности инвестиций, щелкнув Анализ и выбрав Установить измерение. Затем проверьте площадь, соответствующую общей площади каждого ROI. Чтобы записать долю области, занимаемую пороговыми пикселями для каждой рентабельности инвестиций, установите флажки Доля площади и Предел порогового значения.
Проверьте метку Дисплея, чтобы пометить каждую рентабельность инвестиций заголовком изображения, каналом, Z-плоскостью и координатами X/Y. Используйте выбранную Z-плоскость внутриклеточных сальмонелл для записи меток, площади и процентной площади, занимаемой сальмонеллами для каждой отдельной клетки. Откройте roi-cells-acquisitiontitle.
zip-файл, щелкнув меню Файл и выбрав Открыть. Затем нажмите «Измерить» в меню «Менеджер ROI». Выходные данные представляют собой таблицу, сообщающую о выбранных измерениях.
Наконец, сохраните таблицу результатов, выбрав файл и нажав кнопку Сохранить как в окне результатов. Клеточная инвазия, вакуолярная нагрузка и цитозольная гиперрепликация сальмонеллы были визуализированы внутри эпителиальных клеток. Анализ площади выявил значительно более высокое соотношение инфекций у Salmonella typhimurium по сравнению с обоими штаммами Salmonella derby, демонстрируя эффективность анализа площади в обнаружении различий в способности штаммов сальмонеллы колонизировать эпителиальные клетки.
Сальмонелла дерби sipA-удаленный мутантный штамм показал сниженный коэффициент гиперрепликации по сравнению с Salmonella derby дикого типа, что согласуется с ролью sipA в индуцировании гиперрепликации. Не наблюдалось различий в гиперрепликации между Salmonella typhimurium и Salmonella derby wild-type. Одноклеточный анализ не показал существенной разницы в процентном соотношении инфицированных клеток в штаммах Salmonella derby по сравнению с Salmonella typhimurium.
В противном случае штаммы Salmonella derby генерируют среднюю вакуолярную нагрузку значительно ниже, чем Salmonella typhimurium. Не наблюдалось различий между Salmonella typhimurium и Salmonella derby wild-type, в то время как Salmonella derby sipA показало значительное снижение гиперрепликации, что согласуется с результатом анализа площади. Сальмонелла включает в себя несколько сероваров с разнообразной вирулентностью.
Исследование большого количества штаммов с помощью этого быстрого и автоматизированного метода вносит значительный вклад в понимание реального потенциала вирулентности этого патогена.
