이 형광 현미경 방법은 장 상피 세포 내부의 살모넬라 표현형을 자동화된 방식으로 정량화하여 확장 가능한 분해능으로 많은 수의 균주에서 살모넬라균을 연구할 수 있습니다. 우리의 방법은 정량적이고 처리량이 높으며 동시에 자동화되어 면적과 단일 세포 분석에 모두 의존한다는 장점이 있습니다. 세포 내 행동은 많은 박테리아의 숙주-병원체 상호 작용의 중심입니다.
우리의 방법은 살모넬라 이외의 박테리아 병원체에 쉽게 적응할 수있어 발병 기전을 이해하는 데 기여합니다. 이미지를 획득한 후 획득을 열어 단일 셀 분석을 수행합니다. 이미지 J의 czi 파일입니다.
이미지를 클릭하고 색상을 선택한 다음 채널 분할을 선택하여 채널을 분할합니다. 셀 분할의 경우 C1 획득 제목 창에서 Z 평면 이미지를 선택합니다. C1 획득 제목 창을 선택하고 이미지를 클릭한 다음 복제본을 클릭합니다.
그런 다음 선택한 Z 평면의 번호를 씁니다. 제목 상자에 C1Zplane을 작성하고 스택 복제를 선택 취소 한 다음 확인을 클릭하여 선택한 Z 평면 이미지 만 복제합니다. 선택한 Z 평면 이미지를 보여주는 C1Zplane이라는 창이 열립니다.
이제 프로세스를 선택하고 대비 향상을 클릭하여 얻은 C1Zplane 이미지의 이미지 대비를 향상시킵니다. 포화 픽셀을 조정하고 표준화를 선택한 다음 확인을 클릭하여 대비 향상 기술을 적용하여 대비 정규화된 C1Z평면 이미지를 얻습니다. 프로세스로 이동하고 최대값 찾기를 클릭하여 대비 정규화된 C1Z평면 이미지에서 상피 세포를 분할합니다.
그런 다음 모든 상피 세포에 하나의 최대값만 부여하려면 미리 보기 점 선택에 플래그를 지정하고 잡음 허용 오차를 설정합니다. 표시된 최대점당 분할된 각 입자를 표시하는 새로운 이진 마스크형 이미지인 C1Z평면 분할 이미지를 가져오려면 가장자리 최대값 제외에 플래그를 지정하고 분할된 입자를 출력 유형으로 선택한 다음 확인을 클릭합니다. 다음으로, C1Z평면 세그먼트 영상에서 세그먼트화된 셀의 마스크를 만듭니다. 분석, 입자 분석을 차례로 클릭한 다음 마스크 표시 및 가장자리에 제외 옵션을 선택합니다.
크기 간격을 설정하고 확인을 클릭하여 C1Zplane 세그먼트 이진 마스크의 마스크를 가져옵니다. 코드 체계표를 클릭하고 도구 모음에서 표 반전을 선택합니다. 대비 정규화된 C1Zplane 이미지를 임계값으로 지정하려면 이미지로 이동하여 조정, 임계값을 차례로 선택하고 어두운 배경을 확인합니다.
자동 임계값 설정을 기본값으로 설정하고 빨간색 옵션을 선택합니다. 셀이 완전히 빨간색으로 표시되어 어두운 배경이 남을 때까지 최소 컷오프 값을 조정합니다. 적용을 클릭하여 대비 정규화된 C1Zplane 이미지를 셀이 흰색이고 배경이 검은색인 이진 이미지로 변환합니다.
또한 C1Zplane 세그먼트 이진 마스크의 마스크에서 셀 분할을 수정하려면 프로세스를 선택하고 이미지 계산기를 클릭합니다. 그런 다음 이미지 1로 분할된 C1Zplane의 마스크를 선택하고 드롭다운 목록에서 연산 AND를 선택한 다음 임계값이 있는 대비 정규화된 C1Z평면을 이미지 2로 선택합니다. 확인을 클릭하면 ImageJ가 자동으로 출력 이미지의 이름을 C1Z평면 분할 마스크의 결과로 지정합니다.
C1Z평면의 모든 세그먼트 셀에 관심 영역으로 레이블을 지정하려면 분석을 클릭한 다음 입자 분석을 클릭합니다. 앞에서 설명한 대로 크기를 조정하고 아무 것도 표시 옵션을 선택합니다. 관리자에 추가를 선택하여 ROI 관리자 도구에 모든 파티클을 추가합니다.
또한 가장자리에서 제외를 선택하고 확인을 클릭합니다. ROI 데이터를 ROI-셀-획득 제목으로 저장합니다. 더보기 를 클릭하고 저장을 선택하여 ROI 관리자 메뉴를 탐색합니다. 세포 분할을 완료한 후 C2 획득 제목 창에서 작업하여 액포 살모넬라균을 분석합니다.
먼저 프로세스로 이동하여 이미지 계산기를 클릭하고 C2 획득 타이틀을 이미지 1로 선택한 다음 드롭다운 목록에서 빼기 작업을 선택합니다. 그런 다음 C3 획득 타이틀을 이미지 2로 선택하고 새 창 만들기를 선택한 다음 확인을 클릭합니다. 프로세스 스택 창에서 Yes(예)를 클릭하여 전체 Z 스택에 빼기를 적용합니다. 이미지 메뉴를 클릭하고 복제를 선택하여 C2 획득 타이틀 창의 결과를 복제합니다.
그런 다음 중복 스택을 확인하고 확인을 눌러 C2 획득 타이틀 하나의 창에서 결과를 얻습니다. 프로세스로 이동하여 필터를 클릭하고 가우스 흐림 효과를 선택하여 C2 획득 제목 하나의 창에 가우스 흐림 효과를 적용합니다. Sigma 값을 2로 두거나 사용자 지정합니다.
확인을 클릭하고 프로세스 스택 창에서 예를 클릭하여 전체 Z 스택에 가우스 흐림 효과를 적용합니다. 처리를 클릭하고 이미지 계산기를 선택하여 C2 획득 제목 1의 가우스 필터링 결과를 C2 획득 제목 1의 결과로 뺍니다. 이제 C2 획득 제목의 결과를 이미지 1로 선택하고, 드롭다운 목록에서 빼기 작업을 선택하고, C2 획득 제목 1의 결과를 이미지 2로 선택하고, 확인을 클릭합니다. 프로세스 스택 창에서 예를 클릭하여 전체 Z 스택에 빼기를 적용하면 C2 획득 제목의 결과로 ImageJ가 자동으로 이름을 지정한 창을 얻을 수 있습니다.
C2 획득 결과 제목의 결과 배경에서 살모넬라균을 분리하려면 이미지를 클릭하고 조정을 선택한 다음 임계값을 클릭합니다. 그런 다음 어두운 배경을 확인하고 자동 임계값을 Otsu로 설정합니다. 살모넬라균이 완전히 빨간색으로 나타나 어두운 배경이 남을 때까지 최소 컷오프 값을 조정합니다.
적용을 클릭하면 바이너리로 변환이라는 창이 열립니다. 검은 색 배경을 확인하고 확인을 클릭하십시오. C2 획득 결과 제목 이진 윈도우의 결과에서 세포내 살모넬라 초점 평면에 대응하는 중간 Z 평면을 선택한다. 이미지를 클릭한 다음 스택을 클릭한 다음 슬라이스 설정을 선택합니다.
이제 선택한 Z 평면의 번호를 쓰고 확인을 클릭합니다. 그런 다음 분석을 클릭하고 측정 설정을 선택하여 각 ROI에 대해 기록할 측정값을 설정합니다. 그런 다음 각 ROI의 전체 면적에 해당하는 영역을 확인하십시오. 각 ROI에 대해 임계값 픽셀이 차지하는 면적 분율을 기록하려면 면적 분수 및 임계값 제한을 확인합니다.
디스플레이 레이블을 확인하여 모든 단일 ROI에 이미지 제목, 채널, Z 평면 및 X/Y 좌표를 지정합니다. 세포 내 살모넬라균의 선택된 Z 평면을 사용하여 모든 단일 세포에 대해 살모넬라균이 차지하는 레이블, 면적 및 백분율 영역을 기록합니다. ROI-셀-획득 제목을 엽니다.
zip 파일을 클릭하여 파일 메뉴를 클릭하고 열기를 선택합니다. 그런 다음 ROI 관리자 메뉴에서 측정을 클릭합니다. 출력은 선택한 측정값을 보고하는 테이블입니다.
마지막으로 파일을 선택하고 결과 창에서 다른 이름으로 저장을 클릭하여 결과 테이블을 저장합니다. 세포 침습, 액포 부하 및 살모넬라균의 세포질 과복제가 상피 세포 내부에서 시각화되었습니다. 면적 분석 결과 두 살모넬라 더비 균주에 비해 살모넬라 티피뮤리움의 감염률이 유의하게 높았으며, 이는 상피 세포를 식민지화하는 살모넬라 균주의 능력 차이를 감지하는 면적 분석의 효능을 입증했습니다.
살모넬라 더비 sipA-결실된 돌연변이 균주는 살모넬라 더비 야생형에 비해 감소된 과복제 비율을 나타냈으며, 이는 과복제를 유도하는 sipA의 역할과 일치한다. 살모넬라 티피뮤리움과 살모넬라 더비 야생형 사이에 과복제 차이는 관찰되지 않았습니다. 단일 세포 분석은 살모넬라 티피뮤리움과 비교하여 살모넬라 더비 균주에서 감염된 세포의 비율에 유의미한 차이가 없음을 보여주었습니다.
그렇지 않으면, 살모넬라 더비 균주는 살모넬라 티피뮤리움보다 유의하게 낮은 평균 액포 부하를 생성하였다. 살모넬라 티피뮤리움과 살모넬라 더비 야생형 간에 차이가 관찰되지 않은 반면, 살모넬라 더비 sipA는 면적 분석 결과와 일치하는 과복제의 유의한 감소를 나타냈습니다. 살모넬라 균에는 다양한 독성을 가진 여러 혈청 형이 포함됩니다.
이 빠르고 자동화된 방법으로 많은 수의 균주를 조사하는 것은 이 병원체의 실제 독성 잠재력을 이해하는 데 크게 기여합니다.
