Bu floresan mikroskopi yöntemi, bağırsak epitel hücreleri içindeki salmonella fenotiplerini otomatik bir şekilde ölçerek, salmonella'nın ölçeklenebilir çözünürlüğe sahip çok sayıda suş üzerinde incelenmesine izin verir. Yöntemimiz, hem bir alana hem de tek hücreli bir analize dayanarak, aynı anda niceliksel, yüksek verimli ve otomatik olma avantajına sahiptir. Hücre içi davranış, birçok bakterinin konakçı-patojen etkileşiminin merkezindedir.
Yöntemimiz salmonella dışındaki bakteriyel patojenlere kolayca adapte edilebilir ve patogenezlerinin anlaşılmasına katkıda bulunur. Görüntüleri elde ettikten sonra, edinimi açarak tek hücreli analiz gerçekleştirin. ImageJ'deki czi dosyası.
Resmi tıklayıp Renk'i ve ardından Kanalları Böl'ü seçerek kanalları bölün. Hücre segmentasyonu için, C1 alma başlığı penceresinde Z düzlemi görüntüsünü seçin. C1 edinme başlığı penceresini seçin ve resmin üzerine ve ardından kopyaya tıklayın.
Ardından, seçilen Z düzleminin numarasını yazın. Başlık kutusuna C1Zplane yazın, Yığını çoğalt'ın işaretini kaldırın ve yalnızca seçili Z düzlemi görüntüsünü çoğaltmak için Tamam'ı tıklatın. Seçilen Z düzlemi görüntüsünü gösteren C1Zplane adlı bir pencere açılacaktır.
Şimdi İşlem Yap'ı seçip Kontrastı Artır'ı tıklatarak elde edilen C1Zplane görüntüsünün görüntü kontrastını artırın. Doymuş pikselleri ayarlayın, Normalleştir'i işaretleyin ve kontrast normalleştirilmiş bir C1Zplane görüntüsü elde etmek üzere kontrast geliştirme tekniğini uygulamak için Tamam'ı tıklatın. İşlem'e gidin ve epitel hücrelerini kontrast normalleştirilmiş C1Zplane görüntüsünde segmentlere ayırmak için Maxima'yı Bul'u tıklayın.
Ardından, her epitel hücresine yalnızca bir maksimum nokta atfetmek için, Önizleme noktası seçimini işaretleyin ve gürültü toleransını ayarlayın. C1Zplane parçacığı işaretli maksimum noktası başına gösteren yeni bir ikili maske benzeri görüntü olan C1Zplane parçacığını elde etmek için, Kenar maksimumunu hariç tut'u işaretleyin, parçalanmış parçacıkları Çıktı türü olarak seçin ve Tamam'ı tıklatın. Ardından, C1Zplane segmente edilmiş görüntüde parçalı hücrelerden oluşan bir maske oluşturun. Analiz Et'i ve ardından Parçacıkları Analiz Et'i tıklayın, ardından Maskeleri göster ve Kenarlarda hariç tut seçeneklerini belirleyin.
Boyut aralığını ayarlayın ve C1Zplane bölümlenmiş ikili maske maskesini edinmek için Tamam'ı tıklatın. Arama tablosunu tıklatın ve araç çubuğunda Arama tablosunu tersine çevir'i seçin. Kontrast normalleştirilmiş C1Zplane görüntüsünü eşik haline getirmek için görüntüye gidin, Ayarla'yı seçin, Eşik'i seçin ve koyu arka planı kontrol edin.
Otomatik eşik ayarını varsayılan olarak ayarlayın ve kırmızı seçeneği belirleyin. Hücreler tamamen kırmızı görünene ve koyu bir arka plan bırakana kadar minimum kesme değerini ayarlayın. Kontrast normalleştirilmiş C1Zplane görüntüsünü, hücreleri beyaz, arka planı siyah olan ikili bir görüntüye dönüştürmek için Uygula'yı tıklatın.
Ayrıca, C1Zplane segmente edilmiş ikili maske maskesindeki hücre segmentasyonunu düzeltmek için İşlem'i seçin ve Görüntü Hesaplayıcı'ya tıklayın. Ardından, görüntü olarak bölümlere ayrılmış C1Zplane maskesini seçin, açılır listeden işlemi VE işlemini seçin ve eşikli kontrast normalleştirilmiş C1Zplane'yi görüntü iki olarak seçin. Tamam'a tıkladığınızda ImageJ, çıktı görüntüsünü otomatik olarak C1Zplane Segmented Maskesi'nin sonuçları olarak adlandırır.
C1Zplane'in her bir parçalanmış hücresini ilgi alanı olarak etiketlemek için Analiz Et'i ve ardından Parçacıkları Analiz Et'i tıklayın. Boyutu daha önce gösterildiği gibi ayarlayın ve Hiçbir Şey Gösterme seçeneğini belirleyin. Yöneticiye Ekle'yi işaretleyerek tüm parçacıkları YG yöneticisi aracına ekleyin.
Ayrıca, Kenarlarda hariç tut'u işaretleyin ve Tamam'ı tıklayın. ROI verilerini roi-cells-acquisitiontitle olarak kaydedin. Yatırım getirisi yöneticisi menüsünde Daha fazla'yı tıklayıp Kaydet'i seçerek sıkıştırma işlemi gerçekleştirin. Hücre segmentasyonunu bitirdikten sonra, vakuolar salmonellayı analiz etmek için C2 edinme başlığı penceresinde çalışın.
İlk olarak, İşlem'e gidin, Görüntü Hesaplayıcı'ya tıklayın, C2 edinme başlığını görüntü olarak seçin ve açılır listeden Çıkar işlemini seçin. Ardından, C3 alma başlığını ikinci resim olarak seçin, Yeni pencere oluştur'u işaretleyin ve Tamam'ı tıklatın. İşlem Yığını penceresinde Evet'i tıklatarak tüm Z yığınına çıkarma uygulayın. Görüntü menüsüne tıklayıp Çoğalt'ı seçerek C2 edinme başlığı penceresinin sonuçlarını çoğaltın.
Ardından yinelenen yığını kontrol edin ve C2 edinme başlığının sonuçlarını bir pencerede elde etmek için Tamam'a basın. C2 edinme başlığının sonuçlarına Gauss bulanıklığını uygulayın Bir pencere, İşlem'e gidip Filtre'yi tıklatarak ve Gauss bulanıklığını seçerek. Sigma değerini iki olarak bırakın veya özelleştirin.
Tamam'a tıklayın ve İşlem yığını penceresinde Evet'e tıklayarak Gauss bulanıklığını tüm Z yığınına uygulayın. C2 edinme başlığının Gauss filtrelenmiş sonuçlarını birinci olarak, İşlem'e tıklayıp Görüntü Hesaplayıcı'yı seçerek C2 edinme başlığının sonuçlarına çıkarın. Şimdi C2 alma başlığının sonuçlarını resim bir olarak seçin, açılır listeden Çıkar işlemini seçin, C2 alma başlığının sonuçlarını resim iki olarak seçin ve Tamam'ı tıklayın. C2 edinme başlığının sonuçlarının sonuçları olarak ImageJ tarafından otomatik olarak adlandırılan bir pencere elde etmek için İşlem Yığını penceresinde Evet'i tıklatarak tüm Z yığınına çıkarma uygulayın.
Salmonella'yı C2 edinme sonuçlarının sonuçlarının arka planından ayırmak için resmi tıklatın, Ayarla'yı seçin ve Eşik'i tıklatın. Ardından, koyu arka planı kontrol edin ve otomatik eşiği Otsu olarak ayarlayın. Salmonella tamamen kırmızı görünene ve koyu bir arka plan bırakana kadar minimum kesme değerini ayarlayın.
Uygula'ya tıklayın ve İkiliye Dönüştür adlı bir pencere açılacaktır. Siyah arka planı kontrol edin ve Tamam'a tıklayın. C2 edinme başlığı ikili penceresinin sonuçlarının sonuçlarında hücre içi salmonella odak düzlemine karşılık gelen orta Z düzlemini seçin. Görüntüyü ve ardından Yığınlar'ı tıklatın ve ardından Dilimi Ayarla'yı seçin.
Şimdi seçtiğiniz Z düzleminin numarasını yazın ve Tamam'ı tıklayın. Ardından, Analiz Et'i tıklayıp Ölçümü Ayarla'yı seçerek ölçümleri her YG için kaydedilecek şekilde ayarlayın. Ardından, her YG'nin toplam alanına karşılık gelen alanı kontrol edin. Her YG için eşikli piksellerin kapladığı alan kesirini kaydetmek üzere Alan Kesiri ve Eşikle sınırla'yı kontrol edin.
Her bir YG'yi görüntü başlığı, kanal, Z düzlemi ve X/Y koordinatlarıyla etiketlemek için Ekran etiketini kontrol edin. Her bir hücre için salmonellanın kapladığı etiketleri, alanı ve yüzde alanını kaydetmek için hücre içi salmonellanın seçilen Z düzlemini kullanın. ROI-cells-acquisitiontitle öğesini açın.
Dosya menüsünü tıklatıp Aç'ı seçerek zip dosyası. Ardından, YG Yöneticisi menüsünde Ölçüm'e tıklayın. Çıktı, seçilen ölçümleri raporlayan bir tablodur.
Son olarak, dosyayı seçip sonuçlar penceresinde Farklı Kaydet'i tıklatarak sonuç tablosunu kaydedin. Salmonella'nın hücresel invazyonu, vakuolar yükü ve sitozolik hiper-replikasyonu epitel hücrelerinin içinde görselleştirildi. Alan analizi, Salmonella typhimurium'da her iki Salmonella derbi suşuna kıyasla anlamlı derecede daha yüksek bir enfeksiyon oranı ortaya koyarak, salmonella suşlarının epitel hücrelerini kolonize etme kabiliyetindeki farklılıkları tespit etmede alan analizinin etkinliğini göstermiştir.
Salmonella derbi sipA-silinmiş mutant suşu, Salmonella derbisi vahşi tipine kıyasla azalmış bir hiper-replikasyon oranı gösterdi ve sipA'nın hiper-replikasyonu indüklemedeki rolüyle tutarlı oldu. Salmonella typhimurium ve Salmonella derbi vahşi tipi arasında hiperreplikasyon farkı gözlenmedi. Tek hücreli analiz, Salmonella derbi suşlarındaki enfekte hücrelerin yüzdesinde, Salmonella typhimurium'a kıyasla anlamlı bir fark göstermedi.
Aksi takdirde, Salmonella derbi suşları, Salmonella typhimurium'dan anlamlı derecede daha düşük bir ortalama vakuolar yük üretti. Salmonella typhimurium ve Salmonella derbi vahşi tipi arasında fark gözlenmezken, Salmonella derbi sipA, alan analizinin sonucuyla tutarlı olarak hiper-replikasyonda önemli bir azalma göstermiştir. Salmonella, çeşitli virülansı olan birkaç serovar içerir.
Bu hızlı ve otomatik yöntemle çok sayıda suşun araştırılması, bu patojenin gerçek virülans potansiyelini anlamaya önemli ölçüde katkıda bulunur.
