Diese fluoreszenzmikroskopische Methode quantifiziert Salmonellen-Phänotypen in Darmepithelzellen auf automatisierte Weise und ermöglicht so die Untersuchung von Salmonellen an einer großen Anzahl von Stämmen mit skalierbarer Auflösung. Unsere Methode hat den Vorteil, dass sie quantitativ, hoch durchsatzfähig und gleichzeitig automatisiert ist und sowohl auf einer Flächen- als auch auf einer Einzelzellanalyse beruht. Das intrazelluläre Verhalten ist zentral für die Wirt-Pathogen-Interaktion vieler Bakterien.
Unsere Methode kann leicht an andere bakterielle Krankheitserreger als Salmonellen angepasst werden, was zum Verständnis ihrer Pathogenese beiträgt. Führen Sie nach der Aufnahme der Bilder eine Einzelzellanalyse durch, indem Sie die Erfassung öffnen. czi-Datei in ImageJ.
Teilen Sie die Kanäle, indem Sie auf das Bild klicken und Farbe auswählen, gefolgt von Kanäle teilen. Wählen Sie für die Zellsegmentierung das Bild der Z-Ebene im Titelfenster der C1-Erfassung aus. Wählen Sie das Titelfenster der C1-Erfassung aus und klicken Sie auf das Bild gefolgt von dem Duplikat.
Schreiben Sie dann die Nummer der ausgewählten Z-Ebene. Schreiben Sie C1Zplane in das Titelfeld, deaktivieren Sie den Stapel duplizieren und klicken Sie auf OK, um nur das ausgewählte Bild der Z-Ebene zu duplizieren. Ein Fenster namens C1Zplane mit dem ausgewählten Bild der Z-Ebene wird geöffnet.
Verbessern Sie nun den Bildkontrast des erhaltenen C1Zplane-Bildes, indem Sie Prozess auswählen und auf Kontrast verbessern klicken. Passen Sie die gesättigten Pixel an, aktivieren Sie Normalisieren und klicken Sie auf OK, um die Kontrastverstärkungstechnik anzuwenden und ein kontrastnormalisiertes C1Zplane-Bild zu erhalten. Gehen Sie zum Prozess und klicken Sie auf Maxima suchen, um die Epithelzellen im kontrastnormalisierten C1Zplane-Bild zu segmentieren.
Wenn Sie dann jeder Epithelzelle nur einen Maximalpunkt zuweisen möchten, kennzeichnen Sie die Auswahl des Vorschaupunkts und legen Sie die Rauschtoleranz fest. Um das segmentierte C1Zplane-Bild zu erhalten, ein neues binäres maskenähnliches Bild, das jedes segmentierte Partikel pro markiertem Maximalpunkt zeigt, markieren Sie die Kantenmaxima ausschließen, wählen Sie die segmentierten Partikel als Ausgabetyp aus und klicken Sie auf OK. Erstellen Sie als Nächstes eine Maske segmentierter Zellen im segmentierten C1Zplane-Bild. Klicken Sie auf Analysieren, gefolgt von Partikel analysieren, und wählen Sie dann die Optionen Masken anzeigen und An Kanten ausschließen.
Legen Sie das Größenintervall fest und klicken Sie auf OK, um die Maske der segmentierten C1Zplane-Binärmaske zu erhalten. Klicken Sie auf die Nachschlagetabelle, und wählen Sie in der Symbolleiste Nachschlagetabelle umkehren aus. Um den Schwellenwert für das kontrastnormalisierte C1Zplane-Bild festzulegen, wechseln Sie zum Bild, wählen Sie "Anpassen", wählen Sie "Schwellenwert" und überprüfen Sie den dunklen Hintergrund.
Setzen Sie die Einstellung für den automatischen Schwellenwert auf Standard und wählen Sie die rote Option. Passen Sie den minimalen Cutoff-Wert an, bis die Zellen vollständig rot erscheinen und einen dunklen Hintergrund hinterlassen. Klicken Sie auf Anwenden, um das kontrastnormalisierte C1Zplane-Bild in ein Binärbild mit weißen Zellen und schwarzem Hintergrund zu konvertieren.
Um die Zellsegmentierung in der Maske der segmentierten binären C1Zplane-Maske zu korrigieren, wählen Sie Prozess und klicken Sie auf den Bildrechner. Wählen Sie dann die Maske von C1Zplane aus, die als Bild eins segmentiert ist, wählen Sie die Operation AND in der Dropdown-Liste und wählen Sie die kontrastnormalisierte C1Zplane als Bild zwei. Klicken Sie auf OK und ImageJ benennt das Ausgabebild automatisch als Ergebnis von Mask of C1Zplane Segmented.
Um jede einzelne segmentierte Zelle von C1Zplane als Interessenbereich zu kennzeichnen, klicken Sie auf Analysieren und anschließend auf Partikel analysieren. Passen Sie die Größe wie zuvor gezeigt an und wählen Sie die Option "Nichts anzeigen". Fügen Sie alle Partikel zum ROI-Manager-Tool hinzu, indem Sie Zu Manager hinzufügen aktivieren.
Aktivieren Sie außerdem das Kontrollkästchen An Kanten ausschließen und klicken Sie auf OK. Speichern Sie die ROI-Daten als roi-cells-acquisitiontitle. Navigieren Sie durch das ROI-Manager-Menü, indem Sie auf Mehr klicken und Speichern auswählen. Arbeiten Sie nach Abschluss der Zellsegmentierung am Titelfenster der C2-Akquisition, um vakuoläre Salmonellen zu analysieren.
Gehen Sie zuerst zum Prozess, klicken Sie auf den Bildrechner, wählen Sie den C2-Erfassungstitel als Bild aus und wählen Sie die Operation Subtrahieren in der Dropdown-Liste. Wählen Sie dann den C3-Erfassungstitel als Bild zwei aus, aktivieren Sie Neues Fenster erstellen und klicken Sie auf OK. Wenden Sie die Subtraktion auf den gesamten Z-Stapel an, indem Sie im Fenster Prozessstapel auf Ja klicken. Duplizieren Sie die Ergebnisse des C2-Erfassungstitelfensters, indem Sie auf das Menü Bild klicken und Duplizieren auswählen.
Überprüfen Sie dann den doppelten Stapel und drücken Sie OK, um die Ergebnisse des C2-Erfassungstitels in einem Fenster zu erhalten. Wenden Sie Gaußsche Unschärfe auf die Ergebnisse des C2-Erfassungstitels an, indem Sie zum Prozess wechseln, auf den Filter klicken und die Gaußsche Unschärfe auswählen. Lassen Sie den Sigma-Wert zwei oder passen Sie ihn an.
Klicken Sie auf OK und wenden Sie Gaußsche Unschärfe auf den gesamten Z-Stapel an, indem Sie im Fenster Prozessstapel auf Ja klicken. Subtrahieren Sie die Gaußschen gefilterten Ergebnisse des C2-Erfassungstitels eins zu den Ergebnissen des C2-Erfassungstitels, indem Sie auf Prozess klicken und den Bildrechner auswählen. Wählen Sie nun die Ergebnisse des C2-Erfassungstitels als Bild eins aus, wählen Sie die Operation Subtrahieren in der Dropdown-Liste, wählen Sie die Ergebnisse des C2-Erfassungstitels eins als Bild zwei aus und klicken Sie auf OK. Wenden Sie die Subtraktion auf den gesamten Z-Stapel an, indem Sie im Fenster Prozessstapel auf Ja klicken, um ein Fenster zu erhalten, das von ImageJ automatisch als Ergebnis der Ergebnisse des C2-Erfassungstitels benannt wird.
Um Salmonellen vom Hintergrund der Ergebnisse der Ergebnisse des C2-Erfassungstitels zu trennen, klicken Sie auf das Bild, wählen Sie Anpassen und klicken Sie auf den Schwellenwert. Überprüfen Sie dann den dunklen Hintergrund und stellen Sie den automatischen Schwellenwert auf Otsu ein. Passen Sie den minimalen Grenzwert an, bis Salmonellen vollständig rot erscheinen und einen dunklen Hintergrund hinterlassen.
Klicken Sie auf Übernehmen und ein Fenster mit dem Namen Convert to Binary wird geöffnet. Überprüfen Sie den schwarzen Hintergrund und klicken Sie auf OK. Wählen Sie die mittlere Z-Ebene, die der intrazellulären Salmonellen-Fokusebene im binären Fenster Ergebnisse der Ergebnisse des C2-Erfassungstitels entspricht. Klicken Sie auf das Bild gefolgt von Stapel, und wählen Sie dann Slice festlegen aus.
Geben Sie nun die Nummer der Z-Ebene Ihrer Wahl ein und klicken Sie auf OK. Legen Sie als Nächstes die Messungen fest, die für jeden ROI aufgezeichnet werden sollen, indem Sie auf Analysieren klicken und Messung festlegen auswählen. Überprüfen Sie dann den Bereich, der der Gesamtfläche jedes ROI entspricht. Um den Flächenanteil aufzuzeichnen, der von Schwellenwertpixeln für jeden ROI belegt wird, aktivieren Sie den Flächenanteil und Grenzwert auf Schwellenwert.
Aktivieren Sie das Etikett Anzeige, um jeden einzelnen ROI mit Bildtitel, Kanal, Z-Ebene und X/Y-Koordinaten zu beschriften. Verwenden Sie die gewählte Z-Ebene intrazellulärer Salmonellen, um Labels, Fläche und prozentuale Fläche aufzuzeichnen, die von Salmonellen für jede einzelne Zelle belegt sind. Öffnen Sie den Titel roi-cells-acquisition.
ZIP-Datei, indem Sie auf das Menü Datei klicken und Öffnen auswählen. Klicken Sie dann im ROI-Manager-Menü auf Messen. Die Ausgabe ist eine Tabelle, die die ausgewählten Messungen angibt.
Speichern Sie abschließend die Ergebnistabelle, indem Sie die Datei auswählen und im Ergebnisfenster auf Speichern unter klicken. Die zelluläre Invasion, die vakuolare Belastung und die zytosolische Hyperreplikation von Salmonellen wurden in Epithelzellen visualisiert. Die Flächenanalyse ergab eine signifikant höhere Infektionsrate bei Salmonella typhimurium im Vergleich zu beiden Salmonella-Derby-Stämmen, was die Wirksamkeit der Flächenanalyse bei der Erkennung von Unterschieden in der Fähigkeit von Salmonella-Stämmen, Epithelzellen zu besiedeln, zeigt.
Salmonella derby sipA-deleted mutant Stamm zeigte eine reduzierte Hyperreplikationsrate im Vergleich zum Salmonella derby Wildtyp, was mit der Rolle von sipA bei der Induktion der Hyperreplikation übereinstimmt. Es wurde kein Hyperreplikationsunterschied zwischen Salmonella typhimurium und Salmonella derby Wildtyp beobachtet. Die Einzelzellanalyse zeigte keinen signifikanten Unterschied im Prozentsatz infizierter Zellen in Salmonella-Derby-Stämmen im Vergleich zu Salmonella typhimurium.
Andernfalls erzeugten Salmonella-Derby-Stämme eine signifikant niedrigere mittlere vakuoläre Belastung als Salmonella typhimurium. Es wurde kein Unterschied zwischen Salmonella typhimurium und Salmonella derby Wildtyp beobachtet, während Salmonella derby sipA eine signifikante Abnahme der Hyperreplikation zeigte, was mit dem Ergebnis der Flächenanalyse übereinstimmt. Salmonellen umfassen mehrere Serovare mit unterschiedlicher Virulenz.
Die Untersuchung einer großen Anzahl von Stämmen mit dieser schnellen und automatisierten Methode trägt wesentlich zum Verständnis des tatsächlichen Virulenzpotenzials dieses Erregers bei.
