Este método de microscopía de fluorescencia cuantifica los fenotipos de salmonela dentro de las células epiteliales intestinales de forma automatizada, permitiendo el estudio de salmonela en un gran número de cepas con resolución escalable. Nuestro método tiene la ventaja de ser cuantitativo, de alto rendimiento y automatizado al mismo tiempo, confiando tanto en un área como en un análisis de una sola célula. El comportamiento intracelular es fundamental para la interacción huésped-patógeno de muchas bacterias.
Nuestro método se puede adaptar fácilmente a patógenos bacterianos distintos de la salmonela, contribuyendo a la comprensión de su patogénesis. Después de adquirir las imágenes, realice un análisis de una sola celda abriendo la adquisición. czi en ImageJ.
Divida los canales haciendo clic en la imagen y seleccionando Color, seguido de Dividir canales. Para la segmentación de celdas, elija la imagen del plano Z en la ventana de título de adquisición C1. Seleccione la ventana de título de adquisición C1 y haga clic en la imagen seguida del duplicado.
Luego, escribe el número del plano Z elegido. Escriba C1Zplane en el cuadro de título, desactive la pila Duplicar y haga clic en Aceptar para duplicar solo la imagen del plano Z seleccionada. Se abrirá una ventana llamada C1Zplane que muestra la imagen del plano Z seleccionada.
Ahora mejore el contraste de la imagen de C1Zplane obtenida seleccionando Proceso y haciendo clic en Mejorar contraste. Ajuste los píxeles saturados, marque Normalizar y haga clic en Aceptar para aplicar la técnica de mejora del contraste para obtener una imagen C1Zplane normalizada por el contraste. Vaya al proceso y haga clic en Buscar máximos para segmentar las células epiteliales en la imagen C1Zplane normalizada por contraste.
A continuación, para atribuir solo un punto máximo a cada celda epitelial, marque la selección de punto de vista previa y establezca la tolerancia al ruido. Para obtener la imagen segmentada de C1Zplane, una nueva imagen binaria similar a una máscara que muestra cada partícula segmentada por punto máximo marcado, marque Excluir máximos de borde, seleccione las partículas segmentadas como Tipo de salida y haga clic en Aceptar. A continuación, cree una máscara de celdas segmentadas en la imagen segmentada de C1Zplane. Haga clic en Analizar, seguido de Analizar partículas y, a continuación, seleccione las opciones Mostrar máscaras y Excluir en bordes.
Establezca el intervalo de tamaño y haga clic en Aceptar para obtener la máscara de máscara binaria segmentada C1Zplane. Haga clic en la tabla de búsqueda y seleccione Invertir tabla de búsqueda en la barra de herramientas. Para establecer un umbral de la imagen C1Zplane normalizada por contraste, vaya a la imagen, seleccione Ajustar, seleccione Umbral y compruebe el fondo oscuro.
Establezca la configuración de umbral automático en predeterminada y elija la opción roja. Ajuste el valor de corte mínimo hasta que las celdas aparezcan completamente rojas, dejando un fondo oscuro. Haga clic en Aplicar para convertir la imagen C1Zplane normalizada por contraste en una imagen binaria con celdas en blanco y el fondo en negro.
Además, para corregir la segmentación de celdas en la máscara de máscara binaria segmentada C1Zplane, seleccione Procesar y haga clic en la Calculadora de imágenes. A continuación, seleccione la máscara de C1Zplane segmentada como imagen uno, elija la operación Y en la lista desplegable y seleccione el C1Zplane normalizado por contraste umbralizado como imagen dos. Haga clic en Aceptar e ImageJ nombrará automáticamente la imagen de salida como resultados de Máscara de C1Zplane segmentado.
Para etiquetar cada celda segmentada de C1Zplane como una región de interés, haga clic en Analizar, seguido de Analizar partículas. Ajuste el tamaño como se demostró anteriormente y seleccione la opción Mostrar nada. Agregue todas las partículas a la herramienta de gestión de ROI marcando Agregar al administrador.
Además, marque Excluir en bordes y haga clic en Aceptar. Guarde los datos de ROI como roi-cells-acquisitiontitle. deslice el menú del administrador de ROI haciendo clic en Más y seleccionando Guardar. Después de terminar la segmentación celular, trabaje en la ventana de título de adquisición C2 para analizar la salmonela vacuolar.
Primero, vaya al Proceso, haga clic en la Calculadora de imágenes, seleccione el título de adquisición C2 como imagen uno y elija la operación Restar en la lista desplegable. A continuación, seleccione el título de adquisición de C3 como imagen dos, marque Crear nueva ventana y haga clic en Aceptar. Aplique resta a toda la pila Z haciendo clic en Sí en la ventana Pila de proceso. Duplique los resultados de la ventana de título de adquisición C2 haciendo clic en el menú Imagen y seleccionando Duplicar.
Luego verifique la pila duplicada y presione OK para obtener los resultados de la ventana del título de adquisición C2. Aplique el desenfoque gaussiano a los resultados de la ventana del título de adquisición C2 yendo al proceso, haciendo clic en el filtro y seleccionando el desenfoque gaussiano. Deje el valor Sigma como dos o personalícelo.
Haga clic en Aceptar y aplique el desenfoque gaussiano a toda la pila Z haciendo clic en Sí en la ventana Pila de proceso. Reste los resultados filtrados gaussianos del título de adquisición de C2 uno a los resultados del título de adquisición de C2 haciendo clic en Proceso y seleccionando la Calculadora de imágenes. Ahora seleccione los resultados del título de adquisición de C2 como imagen uno, elija la operación Restar en la lista desplegable, seleccione los resultados del título de adquisición de C2 uno como imagen dos y haga clic en Aceptar. Aplique restas a toda la pila Z haciendo clic en Sí en la ventana Pila de procesos para obtener una ventana nombrada automáticamente por ImageJ como resultados de los resultados del título de adquisición C2.
Para separar las salmonelas del fondo de los resultados de los resultados del título de adquisición C2, haga clic en la imagen, seleccione Ajustar y haga clic en el Umbral. Luego, verifique el fondo oscuro y establezca el umbral automático en Otsu. Ajuste el valor de corte mínimo hasta que las salmonelas aparezcan completamente rojas, dejando un fondo oscuro.
Haga clic en Aplicar y se abrirá una ventana llamada Convertir a binario. Compruebe el fondo negro y haga clic en Aceptar. Seleccione el plano Z medio correspondiente al plano de enfoque de salmonelas intracelulares en la ventana binaria de resultados de los resultados del título de adquisición C2. Haga clic en la imagen seguida de Pilas y, a continuación, seleccione Establecer segmentación.
Ahora escriba el número del plano Z de elección y haga clic en Aceptar. A continuación, establezca las mediciones que se registrarán para cada ROI haciendo clic en Analizar y seleccionando Establecer medición. Luego, verifique el área correspondiente al área total de cada ROI. Para registrar la fracción de área ocupada por píxeles umbrales para cada ROI, marque la Fracción de área y Límite al umbral.
Verifique la etiqueta Mostrar para etiquetar cada ROI con el título de la imagen, el canal, el plano Z y las coordenadas X / Y. Utilice el plano Z elegido de salmonelas intracelulares para registrar etiquetas, área y área porcentual ocupada por salmonelas para cada célula. Abra el roi-cells-acquisitiontitle.
zip haciendo clic en el menú Archivo y seleccionando Abrir. Luego, haga clic en Medir en el menú ROI Manager. El resultado es una tabla que informa las medidas seleccionadas.
Finalmente, guarde la tabla de resultados seleccionando el archivo y haciendo clic en Guardar como en la ventana de resultados. La invasión celular, la carga vacuolar y la hiperreplicación citosólica de la salmonela se visualizaron dentro de las células epiteliales. El análisis de área reveló una relación de infección significativamente mayor en Salmonella typhimurium en comparación con ambas cepas de Salmonella derby, lo que demuestra la eficacia del análisis de área para detectar diferencias en la capacidad de las cepas de salmonela para colonizar las células epiteliales.
La cepa mutante eliminada de Salmonella derby sipA mostró una relación de hiperreplicación reducida en comparación con la de tipo salvaje de Salmonella derby, consistente con el papel de sipA en la inducción de hiperreplicación. No se observó diferencia de hiperreplicación entre Salmonella typhimurium y Salmonella derby de tipo salvaje. El análisis de células individuales no mostró diferencias significativas en el porcentaje de células infectadas en las cepas de Salmonella derby en comparación con Salmonella typhimurium.
De lo contrario, las cepas de Salmonella derby generaron una carga vacuolar media significativamente menor que Salmonella typhimurium. No se observaron diferencias entre Salmonella typhimurium y Salmonella derby de tipo salvaje, mientras que Salmonella derby sipA mostró una disminución significativa en la hiperreplicación, consistente con el resultado del análisis de área. Salmonella incluye varios serovares con virulencia diversa.
La investigación de un gran número de cepas mediante este método rápido y automatizado contribuye significativamente a comprender el potencial de virulencia real de este patógeno.
