使用光片荧光显微镜对老化耳蜗进行成像

我们开发了一种光片显微镜，可以将整个耳蜗数字化。该显微镜具有长工作距离的气管物镜，可以对小型小鼠耳蜗到大型人体颞骨进行成像。它用激光束连续切片耳蜗，而不会造成任何机械破坏。

我们的成像方法可用于评估耳蜗的病理变化，例如由于衰老而导致的毛细胞和螺旋神经节神经元的损失。对小鼠实施安乐死并斩首后，通过大脑做一个背腹切口以半切头骨。切除大脑并识别颅骨基腹部分的圆形大疱。

用喇叭打开大疱。然后，可视化并去除耳蜗。在五倍放大的解剖显微镜下，刺穿椭圆形窗口并用锋利的镐取出镫骨。

然后，将镐插入圆形窗口以刺穿膜。要进行固定，请用输液器的切割尖端覆盖打开的圆窗，该输液器连接到装有两毫升福尔马林的一毫升注射器上。在两分钟内通过耳蜗的外淋巴间隙缓慢注入福尔马林，确保福尔马林通过打开的椭圆形窗口离开耳蜗。

修剪耳蜗上多余的组织。将其浸入含有10%福尔马林的瓶子中，然后将其放在旋转器上过夜。对于脱钙，在PBS中冲洗耳蜗三次，每次五分钟。

浸入含有10%EDTA溶液的瓶中。轮流孵育四天，每天更换溶液。然后，用PBS灌注耳蜗三次，并在两次更换之间浸泡15分钟以去除所有EDTA。

洗涤后，用升序浓度的乙醇使耳蜗脱水30分钟。通过旋转浸入罗丹明B溶液中过夜来染色整个耳蜗。用两次100%乙醇从耳蜗中去除多余的染料，每次更换孵育五分钟。

将染色的耳蜗转移到两次变化的Spalteholz溶液中，每次变化30分钟。在澄清溶液中旋转放置过夜。将耳蜗连接到椭圆形和圆形窗膜末端的标本杆上。

确保清除溶液保留在耳蜗内，并且不会形成气泡。使用紫外线活化胶将湿耳蜗的椭圆形和圆形窗口端连接到干燥的试样杆上。用紫外线在耳蜗周围移动，将紫外线胶固化 10 秒钟。

将耳蜗悬浮到充满Spalteholz溶液的光学透明石英荧光计单元中的成像室中，标本棒连接到旋转支架上，该支架也连接到X / Z平移台。然后，使用定制设计的程序以 X 轴和 Z 轴步骤将标本穿过光片，并在整个耳蜗中制作一堆 2D 图像。要处理图像，请将图像堆栈传输到另一台计算机，并将其加载到 3D 渲染程序中以进行 3D 重建和量化。

小鼠耳蜗的直接体积渲染显示了椭圆形和圆形窗口，带有毛细胞的Corti器官，罗森塔尔的运河被分割并呈现体积，并显示螺旋神经节神经元或SGN，沿着其长度。使用TSLIM，对3个月大的年轻小鼠和23个月大的小鼠的耳蜗进行成像并计数SGN。 线性图中描绘的SGN细胞计数作为罗森塔尔管距离的函数，显示与老年动物相比，耳蜗中端和顶端的年轻动物的SGN更大。

SGN的这种明显损失通过使用聚类分析和3D渲染软件可视化。SGN密度差异在色标上表示，其中高密度簇为黄色，蓝色代表低密度区域。聚类分析清楚地描绘了沿罗森塔尔运河长度的细胞密度较低的区域。

光片显微镜旨在产生对齐良好的图像堆栈，从中可以生成结构的3D体积渲染。3D渲染程序允许对结构和不同结构之间的解剖关系进行定量评估。但是，由于 3D 渲染程序提供了许多不同的用户参数，因此有效使用这些程序需要一条重要的学习曲线。