这种方法可以帮助回答听力和平衡领域的基本问题。它描述了如何检测感觉毛细胞功能的两个重要方面，机械转移和预突触活动。这种技术的主要优点是，它使我们能够可视化活体动物中毛细胞的功能，并研究头发细胞的集合如何检测和传输感官信息。
要开始此过程，请使用细钳子和钨丝来设计用于通过头部和尾部固定在硬化的封装剂上的幼虫的针脚。要制作头针，请单手握住一块0.035毫米钨丝。使用另一只手的细钳子，将导线从端弯曲一毫米，达到 90 度。
将钳子更换为细剪刀，并在折弯后切割一毫米，以创建销。然后使用钳子将针脚插入腔室上的硬化封装中。将幼虫放在灌注室的中心，使幼虫平放在硅胶套部上。
使用精细钳子，将 0.035 毫米头固定到垂直于幼虫。将头针插入眼睛和异色囊泡之间，向下插入封装剂。使用第二组钳子稳定幼虫沿着其后侧和腹侧，同时固定。
确保针脚的水平部分接触幼虫，并且不会一直压入包盘。角度针通风口，或稍微指向幼虫的前部，以避免干扰随后的心脏注射和毛细胞成像。使用钳子，将 0.025 毫米尾销插入到尾部，尽可能靠近尾部的尾部。
要将α bungarotoxin注射到幼虫中，使用凝胶加载移液器尖端将溶液的三微升回填到注射针中。将溶液均匀地加载到尖端，无气泡。然后将心脏注射针插入连接到手动微操纵器的移液器支架中。
在立体显微镜下，定位针头，使针头垂直与麻醉幼虫的 AP 轴对齐，向下指向 30 度角。接下来，将移液器支架连接到压力喷油器。将一波α bungarotoxin注射到溶液中，以测试针尖是否清晰。
如果没有看到红色，请非常轻轻地将针尖刮到针刃上，然后重试，直到针清晰。随后，将针头推进到心脏，直到它触及心脏外的皮肤。将针头压入幼虫，并查找心脏前皮肤上色素细胞的凹痕，以确保针头位于相对于幼虫的正确平面上。
然后，将针头推进更远，直到它刺穿皮肤并进入心腔。稍微拉回针头，将α型邦加罗毒素注射到心腔中。寻找心腔的膨胀，或红色染料进入腔。
用一毫升神经元缓冲液轻轻冲洗幼虫三次，以去除残留的MS222。切永远不要去除所有的液体。在灌注室中保持大约1毫微的神经元缓冲液中的幼虫。
在此过程中，使用凝胶加载尖端将 10 微升的神经缓冲液回填到正确断裂的流体喷射针中。将溶液均匀地加载到没有气泡的尖端。然后，将针头插入连接到电动微操纵器的移液器支架中。
将灌注室放入显微镜舞台上的圆形腔室适配器中。移动电动舞台，使幼虫位于视野的中心。随后，转动圆形腔室适配器，使AP进入幼虫与流体喷射针的轨迹大致对齐。
使用透光和差分干扰对比度，将幼虫聚焦到10倍的目标下。然后，提高 10 倍的目标。使用电动微操纵器，将流体喷射针向下进入视场中心，因此被透光照亮，几乎不能接触神经元缓冲液。
降低10倍目标，以专注于幼虫，以确认其位置。将目标放在流体喷射针上。在 x 轴和 y 轴中用微操纵器移动流体喷射针，直到其位置与幼虫的后侧平行。
之后，重新关注幼虫。将针头在 z 轴中向下，将针头沿鱼的后侧放置，离身体 1 毫米远。小心地移动圆形腔室适配器，以确保流体喷射针沿幼虫的 AP 中线对齐。
接下来，切换到60倍水目标。确保目标在神经元缓冲液中被处理。使用精细焦点定位神经瘤。
随后移动motarized阶段，将感兴趣的神经瘤放在视场的中心。保持流体喷射针尖沿鱼的后侧。请勿触摸流体喷射针尖到幼虫或腔室表面。
将流体喷射针与微操纵器一起放置，使其远离神经瘤外边缘 100 微米。然后，专注于尖发的毛发束。流体喷射针的底部应该在这个平面的焦点。
将高速压力夹从手动模式设置为外部模式，以接收来自成像软件的输入。通过按下零按钮将高速压力夹归零，并使用设定点旋钮将静止压力稍微设置为正。使用连接到头级输出的 PSI 气压计确认高速压力夹的静止输出。
要确定刺激发束所需的压力，请应用 0.125 和 0.25 伏输出的测试刺激，输出为 200-500 毫秒。对于每个测试刺激，测量毛束尖的偏转距离，基诺西利亚。选择将束距离移动约 5 微米的压力。
确保基诺西利亚的尖端始终保持焦点。要获取单平面图像，请选择在帧 30 后 30 帧采集期间以 3 秒为单位交付的刺激。要测量机械敏钙反应，请关注毛发束的基座，并开始图像采集。
要测量突触前钙反应，请聚焦在毛细胞底部，然后开始图像采集。此处概述了在模拟过程中，在神经瘤中可视化 GCaMP6S 强度中时空变化的步骤。时间根据时间戳从左到右表示。
顶行显示 70 帧 GCaMP6S F 图像序列中的 14 个时态条中的 5 个。在第二行中，基线已从每个 GCaMP6S F 装箱图像中删除，以创建增量 F 图像。在第三行中，增量 F 图像已从灰度转换为红色热查找表。
在底部行中，第三行已叠加到上行的 F 图像上。在尝试此过程时，请务必记住确保正确固定幼虫并使用适当的控制，如手稿中所述，从数据中排除运动伪影。使用α邦加毒素可能是危险的。
采取预防措施非常重要，例如在处理时戴手套。
