我们的方案认识到需要在体外更好地概括人类血脑屏障，以研究影响中风后恢复的复杂细胞机制。我们的三重模型表现出强大的完整性，这部分与油井插入物的大隔室有关，使我们能够降低变化频率并避免种群中断。我们的模型是研究缺血性中风期间和之后血脑屏障发生的分子和细胞变化的绝佳工具。
我们的方案允许发现新的靶点和治疗方法，以改善中风后的恢复。目前缺血性卒中的治疗方法对时间敏感，因此并不总是有效的。首先在T75培养瓶中培养HBVP，该培养瓶具有活化表面，用于细胞粘附在5%二氧化碳培养箱中，温度为37摄氏度，直至汇合。
一旦达到汇合，吸出旧的周细胞培养基，并用五毫升温暖的Dulbecco的PBS洗涤细胞。吸出Dulbecco的PBS，并使用四毫升温热的胰蛋白酶EDTA溶液和一毫升Dulbecco的PBS的组合将细胞从烧瓶中分离出来。将烧瓶在 37 摄氏度下在二氧化碳培养箱中孵育五分钟。
在显微镜下观察以确认细胞是否与烧瓶分离。向烧瓶中加入5毫升含有2%FBS的温热周细胞培养基，并将分离的细胞转移到50毫升离心管中。以200g离心细胞悬液三分钟，使细胞在管底部形成沉淀。
从管中吸出培养基，确保细胞沉淀保持完整。将细胞沉淀重新悬浮在周细胞培养基中。根据细胞的汇合度和所需的孔插入物数量计算培养基量。
取10微升重新悬浮的细胞，将它们放入细胞计数载玻片中，并计数细胞数。确定细胞密度，并在一毫升周细胞培养基中每个插入物接种300，000个细胞到孔插入物的光位侧。如文本手稿中所述，使用含有2%FBS的星形胶质细胞培养原代人星形胶质细胞。
测定细胞密度并将每孔接种300， 000个细胞到组织培养六孔板的底部。盖上板以防止蒸发并孵育过夜。同样，如文本手稿中所述，使用含有10%FBS的完整经典培养基在组织培养皿中培养HBMEC。
从培养箱中取出含有星形胶质细胞的组织培养六孔板和含有周细胞的孔插入物。从组织培养六孔板中吸出星形胶质细胞培养基，并向每个孔中加入一毫升周细胞培养基和一毫升星形胶质细胞培养基。从孔插入物中吸出周细胞培养基，并将其放入含有接种星形胶质细胞的组织培养六孔板中。
在两毫升完整的经典培养基中以每孔300，000个细胞的密度接种HBMEC，到同一孔插入物的顶端侧。用Dulbecco的PBS清洗细胞三次。对于接受氧-葡萄糖剥夺的三重细胞培养物，向顶端和基底外侧区室添加无葡萄糖培养基。
用新鲜培养基和常氧对照细胞培养物替换培养基。将对照三重培养物置于37摄氏度的5%二氧化碳培养箱中。将含有20毫升无菌水的培养皿放入缺氧培养箱室中，以提供足够的培养物加湿。
通过松开环夹打开腔室，然后将细胞培养物排列在架子上。通过固定环夹密封腔室。打开腔室的入口和出口，并从腔室流量计的顶部连接管道。
通过空气过滤器将管道从流量计底部连接到气罐。逆时针转动罐体流量控制阀以允许最小的气体流量。顺时针转动，缓慢打开调压阀。
用气体混合物以每分钟 20 升的流速冲洗腔室五分钟。断开腔室与气源的连接，并牢固地关闭两个白色塑料夹。顺时针转动关闭储罐流量控制阀。
逆时针转动关闭压力调节阀。将缺氧室置于37摄氏度的常规培养箱中四个小时。将灭菌的TEER仪器放入生物安全柜中，并将电极插入上皮伏特欧姆表。
在 30 毫升 70% 异丙醇溶液中对电极进行至少 30 分钟的灭菌。打开TEER仪器并将功能设置为欧姆。从 70% 异丙醇溶液中取出电极，并将它们放入 20 毫升 Dulbecco 的 PBS 中至少 30 分钟，直到 TEER 设备上的数字读数读数为零欧姆。
将电极的长插脚插入空白井插入控件的井插入机库中的三个开口之一，将其降低，直到它接触孔的底部。确保短插脚位于孔插入物底部的顶端培养物上方。等到 TEER 仪器上的数字读数值水平关闭后再记录该值。
将电极放回Dulbecco的PBS中，以便在测量之间清洗它们。继续收集另外两个空白孔插入对照的所有TEER测量值。如前所述收集样品板的TEER测量值。
完成所有测量后，将电极放回70%异丙醇溶液中30分钟。然后将电极与TEER仪器断开连接并使其风干。计算 TEER 值。
从基底外侧室吸出培养基，并在三重细胞培养血脑屏障模型中用两毫升酚红游离内皮细胞生长培养基替换它。用HBSS洗涤顶端隔室中的细胞两次。在顶端隔室中加入一毫升FITC葡聚糖溶液，并用铝箔覆盖板，然后将板放入37摄氏度的培养箱中，用5%二氧化碳放置一小时。
从基底外侧隔室中取出 100 微升培养基，并将其转移到黑色 96 孔板中。使用酶标仪测量荧光，激发和发射波长分别设置为 480 和 530 纳米。在聚-D-赖氨酸包被的35毫米玻璃底培养皿的中心接种200微升HBMEC，原代星形胶质细胞和HBVP，密度为每培养皿150， 000个细胞。
在播种HBMEC之前，在培养皿的底部涂上附着因子。让细胞附着在玻璃表面上，将它们在二氧化碳培养箱中在 37 摄氏度下放置过夜。一旦达到汇合，丢弃培养基并加入两毫升预热的无葡萄糖培养基用于氧-葡萄糖剥夺或正常培养基用于对照。
氧-葡萄糖剥夺处理后，在所有培养皿中用成像优化培养基替换培养基，然后按照文本手稿中所述使用GFP滤光片和顶级共聚焦显微镜培养箱进行荧光活细胞成像。通过测定氧-葡萄糖剥夺前后以及再氧合 24 小时后的 TEER，评估所示血脑屏障模型配置中内皮单层的屏障完整性。氧-葡萄糖剥夺持续4小时，仅在HBMEC单一栽培以及与HBMEC和HBVP共培养模型中导致TEER值显着降低。
这些降低的水平在重新氧合24小时后达到基线水平。氧-葡萄糖剥夺后，三重共培养模型中的TEER值显著高于双共培养对照或单培养对照。与常氧对照相比，内皮单层对20千道尔顿分子量FITC dextran的细胞旁通透性在HBMEC单培养中急剧增加，在与HBMEC和HBVP共培养模型中的渗透性较小。
此外，在常氧和氧-葡萄糖剥夺条件下，20千道尔顿FITC葡聚糖通透性水平在所有模型中是所有模型中最低的。在任何模型中，在内皮单层的70千道尔顿FITC葡聚糖通量中均未观察到变化。暴露于氧 - 葡萄糖剥夺的所有主要人类类型都表现出强烈的绿色荧光，证明成像的活细胞是缺氧的。
将人脑血管周细胞接种在孔插入物的光位侧后，用翻转板覆盖它们以防止蒸发非常重要。在我们的模型中，我们使用相对较小的0.4微米孔径的聚酯孔插入物，使其适用于筛选任何需要穿过血脑屏障进行治疗的疾病的候选药物。如果需要，该技术为可视化蛋白质和转运蛋白的修饰提供了绝佳的机会。
