يعترف بروتوكولنا بالحاجة إلى تلخيص أفضل للحاجز الدموي الدماغي البشري في المختبر لدراسة الآليات الخلوية المعقدة التي تؤثر على التعافي بعد السكتة الدماغية. يظهر نموذجنا الثلاثي سلامة قوية ترتبط جزئيا بالتقسيم الكبير لإدخالات الآبار ، مما يسمح لنا بتقليل وتيرة التغيير وتجنب تعطيل السكان. نموذجنا هو أداة رائعة لدراسة التغيرات الجزيئية والخلوية التي تحدث في الحاجز الدموي الدماغي أثناء وبعد السكتة الدماغية.
يسمح بروتوكولنا باكتشاف أهداف وعلاجات جديدة لتحسين التعافي بعد السكتة الدماغية. العلاجات الحالية للسكتة الدماغية الإقفارية حساسة للوقت وبالتالي ليست فعالة دائما. ابدأ بزراعة HBVP في قوارير ثقافة T75 بسطح نشط للالتصاق الخلايا داخل حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية حتى تتلاقى.
بمجرد الوصول إلى نقطة التقاء ، استنشق الوسط القديم pericyte واغسل الخلايا بخمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني Dulbecco الدافئ. قم بشفط PBS الخاص ب Dulbecco وافصل الخلايا عن القارورة باستخدام مزيج من أربعة ملليلتر من محلول EDTA التربسين الدافئ وملليلتر واحد من PBS من Dulbecco. احتضان القارورة لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون.
عرض تحت المجهر للتأكد مما إذا كانت الخلايا منفصلة عن القارورة. أضف خمسة ملليلتر من وسط pericyte الدافئ الذي يحتوي على 2٪ FBS إلى القارورة وانقل الخلايا المنفصلة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 ملليلتر. قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية لمدة ثلاث دقائق عند 200 جم مما يسمح للخلايا بتكوين حبيبات في قاع الأنبوب.
قم بشفط الوسط من الأنبوب لضمان بقاء حبيبات الخلية سليمة. إعادة تعليق بيليه الخلية في وسط pericyte. احسب كمية الوسط اعتمادا على التقاء الخلايا وعدد إدخالات البئر المطلوبة.
خذ 10 ميكرولتر من الخلايا المعاد تعليقها ، وضعها في شريحة عد الخلايا ، وعد عدد الخلايا. تحديد كثافة الخلية والبذور 300،000 خلية لكل إدراج في ملليلتر واحد من وسط pericyte على الجانب abluminal من إدراج البئر. قم بزراعة الخلايا النجمية البشرية الأولية باستخدام وسط الخلايا النجمية الذي يحتوي على 2٪ FBS كما هو موضح في مخطوطة النص.
تحديد كثافة الخلية والبذور 300،000 خلية لكل بئر على الجزء السفلي من الأنسجة زراعة ستة ألواح الآبار. قم بتغطية اللوحة لمنع التبخر واحتضانها طوال الليل. وبالمثل ، قم بزراعة HBMEC في أطباق زراعة الأنسجة باستخدام وسيط كلاسيكي كامل يحتوي على 10٪ FBS كما هو موضح في مخطوطة النص.
أخرج لوحات زراعة الأنسجة المكونة من ستة آبار تحتوي على الخلايا النجمية وإدراج البئر الذي يحتوي على pericytes من الحاضنة. استنشاق وسط الخلية النجمية من ألواح زراعة الأنسجة المكونة من ستة آبار وإضافة ملليلتر واحد من وسط pericyte ومليلتر واحد من وسط الخلايا النجمية إلى كل بئر. استنشاق وسط pericyte من إدخالات البئر ووضعها في لوحات زراعة الأنسجة ستة آبار تحتوي على الخلايا النجمية البذرة.
قم بزرع HBMEC بكثافة 300،000 خلية لكل بئر في مليلتر من الوسط الكلاسيكي الكامل على الجانب القمي من نفس إدخالات البئر. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني من Dulbecco. بالنسبة لمزارع الخلايا الثلاثية المعرضة للحرمان من الأكسجين والجلوكوز ، أضف وسيطا خاليا من الجلوكوز إلى كل من المقصورات القمية والقاعدية.
استبدل وسط الاستزراع بوسط جديد وثقافات خلية تحكم طبيعية. ضع الثقافات الثلاثية للتحكم في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية. ضع طبق بتري يحتوي على 20 مل من الماء المعقم في غرفة حاضنة نقص الأكسجة لتوفير ترطيب مناسب للثقافات.
افتح الغرفة عن طريق تحرير المشبك الدائري ، ثم رتب ثقافات الخلايا على الرفوف. أغلق الغرفة عن طريق تأمين المشبك الدائري. افتح منافذ مدخل ومخرج الغرفة وقم بتوصيل الأنبوب من أعلى مقياس تدفق الغرفة.
قم بتوصيل الأنبوب من أسفل مقياس التدفق بخزان الغاز عبر مرشح الهواء. افتح صمام التحكم في تدفق الخزان عن طريق تدويره عكس اتجاه عقارب الساعة للسماح بالحد الأدنى من تدفق الغاز. افتح صمام منظم الضغط ببطء عن طريق الدوران في اتجاه عقارب الساعة.
اغسل الغرفة بخليط الغاز لمدة خمس دقائق بمعدل تدفق 20 لترا في الدقيقة. افصل الغرفة عن مصدر الغاز وأغلق كلا المشابك البلاستيكية البيضاء بإحكام. قم بإيقاف تشغيل صمام التحكم في تدفق الخزان عن طريق الدوران في اتجاه عقارب الساعة.
أغلق صمام منظم الضغط عن طريق الدوران عكس اتجاه عقارب الساعة. ضع غرفة نقص الأكسجة في حاضنة تقليدية عند 37 درجة مئوية لمدة أربع ساعات. ضع أداة TEER المعقمة في خزانة السلامة الحيوية وقم بتوصيل الأقطاب الكهربائية بمقياس فولت أوم الظهاري.
تعقيم الأقطاب الكهربائية في 30 ملليلتر من محلول كحول الأيزوبروبيل 70٪ لمدة لا تقل عن 30 دقيقة. قم بتشغيل أداة TEER واضبط الوظيفة على أوم. قم بإزالة الأقطاب الكهربائية من محلول كحول الأيزوبروبيل بنسبة 70٪ وضعها في 20 ملليلتر من برنامج تلفزيوني دولبيكو لمدة لا تقل عن 30 دقيقة حتى تقرأ القراءة الرقمية على جهاز TEER صفر أوم.
أدخل الشق الطويل للقطب من خلال إحدى الفتحات الثلاث في حظيرة إدخال البئر في التحكم في إدخال البئر الفارغ وخفضه حتى يلامس قاع البئر. تأكد من أن الشق القصير يستريح فوق الثقافة القمية في الجزء السفلي من إدخال البئر. انتظر حتى يتم إيقاف قيم القراءة الرقمية على مستوى أداة TEER قبل تسجيل القيمة.
ضع الأقطاب الكهربائية مرة أخرى في برنامج تلفزيوني Dulbecco لغسلها بين القياسات. استمر في جمع جميع قياسات TEER لاثنين من عناصر التحكم في إدراج البئر الفارغة. اجمع قياسات TEER لألواح العينة كما هو موضح سابقا.
بمجرد إجراء جميع القياسات ، يعود القطب إلى محلول كحول الأيزوبروبيل بنسبة 70٪ لمدة 30 دقيقة. ثم افصل الأقطاب الكهربائية عن أداة TEER واتركها تجف في الهواء. احسب قيم TEER.
استنشاق الوسط من الحجرة القاعدية واستبداله بمليلين من وسط نمو الخلايا البطانية الحرة باللون الأحمر الفينول في نموذج الحاجز الدموي الدماغي لثقافة الخلايا الثلاثية. اغسل الخلايا في المقصورة القمية مرتين باستخدام HBSS. أضف ملليلتر واحد من محلول ديكستران FITC في المقصورة القمية وقم بتغطية اللوحة بورق الألمنيوم ، ثم ضع اللوحة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة واحدة.
خذ 100 ميكرولتر من الوسط من المقصورات القاعدية وانقلها إلى لوحة سوداء ذات 96 بئرا. قم بقياس التألق باستخدام قارئ الصفائح الدقيقة مع ضبط الأطوال الموجية للإثارة والانبعاث على 480 و 530 نانومتر على التوالي. قم بزرع 200 ميكرولتر من HBMEC والخلايا النجمية الأولية و HBVP في وسط أطباق القاع الزجاجي المطلي ب poly-D-lysine مقاس 35 ملم بكثافة 150،000 خلية لكل طبق.
قبل بذر "إتش بي إم إي سي"، قم بتغطية الجزء السفلي من الأطباق بعامل الربط. اسمح للخلايا بالالتصاق بالسطح الزجاجي عن طريق تركها طوال الليل عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون. بمجرد الوصول إلى نقطة التقاء ، تخلص من وسط الاستزراع وأضف مليلتر من الوسط الخالي من الجلوكوز الذي تم تسخينه مسبقا للحرمان من الأكسجين والجلوكوز أو الوسط العادي للضوابط.
بعد علاج الحرمان من الأكسجين والجلوكوز ، استبدل الوسيط بوسيط التصوير المحسن في جميع الأطباق ، ثم قم بإجراء تصوير الخلايا الحية الفلورية باستخدام مرشح GFP وحاضنة المجهر متحد البؤر في المرحلة العليا كما هو موضح في مخطوطة النص. تم تقييم سلامة الحاجز الأحادي البطاني في تكوينات نموذج الحاجز الدموي الدماغي المشار إليه من خلال تحديد TEER قبل وبعد الحرمان من الأكسجين والجلوكوز ، وكذلك بعد 24 ساعة من إعادة الأكسجين. لمدة أربع ساعات، تسبب الحرمان من الأكسجين والجلوكوز في انخفاض كبير في قيم TEER فقط في الزراعة الأحادية ل HBMEC ونموذج الاستزراع المشترك مع HBMEC و HBVP.
وصلت هذه المستويات المنخفضة إلى مستويات خط الأساس بعد 24 ساعة من إعادة الأكسجين. كانت قيم TEER في نموذج الزراعة المشتركة الثلاثية أعلى بكثير من تلك الموجودة في ضوابط الزراعة المشتركة المزدوجة أو التحكم في الزراعة الأحادية مباشرة بعد الحرمان من الأكسجين والجلوكوز. زادت نفاذية الطبقات الأحادية البطانية إلى 20 كيلو دالتون من الكتلة الجزيئية ، FITC dexthan ، بشكل كبير في الزراعة الأحادية HBMEC وبدرجة أقل في نموذج الاستزراع المشترك مع HBMEC و HBVP مقارنة بالضوابط المعيارية.
علاوة على ذلك ، كانت مستويات نفاذية ديكستران 20 كيلودالتون FITC هي الأدنى في نموذج حاجز الدم الثلاثي بين الدماغ بين جميع النماذج في ظل ظروف الحرمان من الجلوكوز والأكسجين المعياري. لم يلاحظ أي تغييرات في تدفق 70 كيلودالتون ، FITC ديكستران عبر أحاديات الطبقة البطانية في أي من النماذج. أظهرت جميع الأنواع البشرية الأولية المعرضة للحرمان من الأكسجين والجلوكوز مضانا أخضر قويا ، مما يثبت أن الخلايا الحية المصورة كانت تعاني من نقص الأكسجين.
بعد زرع pericytes الأوعية الدموية في الدماغ البشري على الجانب abluminal من إدراج البئر ، من المهم جدا تغطيتها مع لوحة الوجه لمنع التبخر. في نموذجنا ، نستخدم قطر مسام صغير نسبيا يبلغ 0.4 ميكرومتر من إدخالات بئر البوليستر مما يجعله مناسبا لفحص الأدوية المرشحة لأي مرض يتطلب عبور الحاجز الدموي الدماغي للعلاج. توفر هذه التقنية فرصة ممتازة لتصور تعديل البروتينات والناقلات إذا لزم الأمر.
