Protokolümüz, inme sonrası iyileşmeyi etkileyen karmaşık hücresel mekanizmaların incelenmesi için insan kan-beyin bariyerini in vitro olarak daha iyi özetleme ihtiyacını kabul etmektedir. Üçlü modelimiz, kısmen kuyu uçlarının büyük bölümlenmesiyle ilgili sağlam bir bütünlük sergileyerek değişim sıklığını azaltmamıza ve popülasyonların bozulmasını önlememize olanak tanır. Modelimiz, iskemik inme sırasında ve sonrasında kan-beyin bariyerinde meydana gelen moleküler ve hücresel değişiklikleri incelemek için harika bir araçtır.
Protokolümüz, inme sonrası iyileşmeyi iyileştirmek için yeni hedeflerin ve terapötiklerin keşfedilmesine izin verir. İskemik inme için mevcut tedaviler zamana duyarlıdır ve sonuç olarak her zaman etkili değildir. T75 kültür şişelerinde HBVP'yi, birleşene kadar% 5'lik bir karbondioksit inkübatörü içinde% 5 karbondioksit inkübatörü içinde hücre yapışması için aktif bir yüzeye sahip olarak yetiştirerek başlayın.
Birleşmeye ulaşıldıktan sonra, eski perisit ortamını aspire edin ve hücreleri beş mililitre ılık Dulbecco'nun PBS'si ile yıkayın. Dulbecco'nun PBS'sini aspire edin ve dört mililitre sıcak tripsin EDTA çözeltisi ve bir mililitre Dulbecco'nun PBS'sinin bir kombinasyonunu kullanarak hücreleri şişeden ayırın. Şişeyi bir karbondioksit inkübatöründe 37 santigrat derecede beş dakika boyunca inkübe edin.
Hücrelerin şişeden ayrılıp ayrılmadığını doğrulamak için mikroskop altında görüntüleyin. Şişeye% 2 FBS içeren beş mililitre ılık perisit ortamı ekleyin ve ayrılan hücreleri 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Hücre süspansiyonunu 200 g'da üç dakika boyunca santrifüj ederek hücrelerin tüpün dibinde bir pelet oluşturmasını sağlayın.
Hücre peletinin bozulmadan kalmasını sağlamak için ortamı tüpten aspire edin. Hücre peletini perisit ortamında tekrar askıya alın. Hücrelerin birleşmesine ve gereken kuyu eklerinin sayısına bağlı olarak ortam miktarını hesaplayın.
Yeniden askıya alınan hücrelerin 10 mikrolitresini alın, bunları bir hücre sayma slaytına yerleştirin ve hücre sayısını sayın. Hücre yoğunluğunu belirleyin ve kuyu eklerinin abluminal tarafına bir mililitre perisit ortamında kesici uç başına 300.000 hücre tohumlayın. Metin makalesinde açıklandığı gibi% 2 FBS içeren astrosit ortamını kullanarak birincil insan astrositlerini geliştirin.
Hücre yoğunluğunu belirleyin ve doku kültürünün altı kuyucuklu plakalarının dibine kuyucuk başına 300.000 hücre tohumlayın. Buharlaşmayı önlemek için plakayı örtün ve gece boyunca inkübe edin. Benzer şekilde, HBMEC'yi doku kültürü kaplarında, metin makalesinde açıklandığı gibi% 10 FBS içeren eksiksiz klasik ortam kullanarak geliştirin.
Astrositler içeren doku kültürü altı kuyucuklu plakaları ve perisitler içeren kuyu eklerini inkübatörden çıkarın. Astrosit ortamını doku kültürü altı kuyucuklu plakalardan aspire edin ve her bir kuyucuğa bir mililitre perisit ortamı ve bir mililitre astrosit ortamı ekleyin. Perisit ortamını kuyu eklerinden aspire edin ve tohumlanmış astrositleri içeren doku kültürü altı kuyucuklu plakalara yerleştirin.
Tohum HBMEC, iki mililitre tam klasik ortamda kuyu başına 300.000 hücre yoğunluğunda aynı kuyunun apikal tarafına yerleştirilir. Hücreleri Dulbecco'nun PBS'si ile üç kez yıkayın. Oksijen-glikoz yoksunluğuna maruz kalan üçlü hücre kültürleri için, hem apikal hem de bazolateral bölmelere glikozsuz ortam ekleyin.
Kültür ortamını taze ortam ve normoksik kontrol hücresi kültürleri ile değiştirin. Kontrol üçlü kültürlerini% 5 karbondioksit inkübatörüne 37 santigrat derecede yerleştirin. Kültürlerin yeterli nemlendirilmesini sağlamak için hipoksi inkübatör odasına 20 mililitre steril su içeren bir Petri kabı yerleştirin.
Halka kelepçesini serbest bırakarak odayı açın, ardından hücre kültürlerini raflara yerleştirin. Halka kelepçesini sabitleyerek odayı kapatın. Odanın giriş ve çıkış portlarını açın ve boruyu odanın debimetresinin üstünden takın.
Boruyu debimetrenin altından bir hava filtresi aracılığıyla gaz tankına takın. Minimum gaz akışına izin vermek için tank akış kontrol valfini saat yönünün tersine çevirerek açın. Saat yönünde dönerek basınç regülatörü valfini yavaşça açın.
Odayı gaz karışımı ile dakikada 20 litre akış hızında beş dakika boyunca yıkayın. Odayı gaz kaynağından ayırın ve her iki beyaz plastik kelepçeyi sıkıca kapatın. Saat yönünde dönerek tank akış kontrol valfini kapatın.
Saat yönünün tersine dönerek basınç regülatörü valfini kapatın. Hipoksi odasını dört saat boyunca 37 santigrat dereceye ayarlanmış geleneksel bir inkübatöre yerleştirin. Sterilize edilmiş TEER cihazını biyogüvenlik kabinine yerleştirin ve elektrotları epitel volt ohm metreye takın.
Elektrotları en az 30 dakika boyunca 30 mililitre% 70 izopropil alkol çözeltisinde sterilize edin. TEER cihazını açın ve işlevi ohm olarak ayarlayın. Elektrotları% 70 izopropil alkol çözeltisinden çıkarın ve TEER cihazındaki dijital okuma sıfır ohm okuyana kadar en az 30 dakika boyunca 20 mililitre Dulbecco'nun PBS'sine yerleştirin.
Elektrotun uzun çatalını, boş kuyu ekleme kontrolünün kuyu yerleştirme hangarındaki üç açıklıktan birinden geçirin ve kuyunun dibine dokunana kadar indirin. Kısa çatalın, kuyu ucunun altındaki apikal kültürün üzerinde durduğundan emin olun. Değeri kaydetmeden önce TEER cihazındaki dijital okuma değerleri aynı seviyeye gelene kadar bekleyin.
Elektrotları ölçümler arasında yıkamak için Dulbecco'nun PBS'sine geri yerleştirin. İki boş kuyu eki kontrolü için tüm TEER ölçümlerini toplamaya devam edin. Daha önce gösterildiği gibi numune plakalarının TEER ölçümlerini toplayın.
Tüm ölçümler yapıldıktan sonra, elektrot 30 dakika boyunca% 70 izopropil alkol çözeltisine geri döner. Ardından elektrotları TEER cihazından ayırın ve havayla kurumasını bekleyin. TEER değerlerini hesaplayın.
Ortamı bazolateral bölmeden aspire edin ve üçlü hücre kültürü kan-beyin bariyeri modelinde iki mililitre fenol kırmızı serbest endotel hücre büyüme ortamı ile değiştirin. Apikal bölmedeki hücreleri HBSS ile iki kez yıkayın. Apikal bölmeye bir mililitre FITC dekstran çözeltisi ekleyin ve plakayı alüminyum folyo ile örtün, ardından plakayı bir saat boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat dereceye ayarlanmış inkübatöre yerleştirin.
Bazolateral bölmelerden 100 mikrolitre ortam alın ve siyah bir 96 delikli plakaya aktarın. Floresansı, uyarma ve emisyon dalga boyları sırasıyla 480 ve 530 nanometreye ayarlanmış bir mikroplaka okuyucu kullanarak ölçün. Tohum 200 mikrolitre HBMEC, birincil astrositler ve HBVP'nin merkezinde poli-D-lizin kaplı 35 milimetre cam taban tabakları, çanak başına 150.000 hücre yoğunluğunda.
HBMEC'yi tohumlamadan önce, bulaşıkların dibini bağlantı faktörü ile kaplayın. Hücrelerin bir karbondioksit inkübatöründe gece boyunca 37 santigrat derecede bırakarak cam yüzeye yapışmasına izin verin. Birleşmeye ulaşıldıktan sonra, kültür ortamını atın ve oksijen-glikoz yoksunluğu için iki mililitre önceden ısıtılmış glikozsuz ortam veya kontroller için normal ortam ekleyin.
Oksijen-glukoz yoksunluğu tedavisinden sonra, ortamı tüm yemeklerde görüntüleme için optimize edilmiş ortamla değiştirin, ardından GFP filtresi ve metin makalesinde açıklandığı gibi üst aşama konfokal mikroskop inkübatörü ile floresan canlı hücre görüntülemesi gerçekleştirin. Belirtilen kan-beyin bariyer modeli konfigürasyonlarında endotel tek katmanının bariyer bütünlüğü, oksijen-glikoz yoksunluklarından önce ve sonra ve ayrıca 24 saatlik yeniden oksijenasyondan sonra TEER belirlenerek değerlendirildi. Dört saat boyunca oksijen-glukoz yoksunluğu sadece HBMEC monokültüründe ve HBMEC ve HBVP ile ko-kültür modelinde TEER değerlerinde önemli bir azalmaya neden olmuştur.
Bu azalan seviyeler, 24 saatlik yeniden oksijenlenmenin ardından temel seviyelere ulaştı. Üçlü ko-kültür modelindeki TEER değerleri, oksijen-glukoz yoksunluğundan hemen sonra çift ko-kültür kontrolleri veya monokültür kontrolündekilerden anlamlı derecede yüksekti. Endotel monokatmanlarının 20 kilodalton moleküler kütleye, FITC dextran'a parasellüler geçirgenliği, HBMEC monokültüründe ve HBMEC ve HBVP ile ko-kültür modelinde normoksik kontrollere kıyasla daha az ölçüde artmıştır.
Ayrıca, 20 kilodalton FITC dekstran geçirgenlik seviyeleri, normoksik ve oksijen-glikoz yoksunluğu koşulları altındaki tüm modeller arasında üçlü beyin-kan bariyeri modelinde en düşük seviyedeydi. Modellerin hiçbirinde endotel monokatmanları arasında 70 kilodalton, FITC dekstran akısında herhangi bir değişiklik gözlenmedi. Oksijen-glikoz yoksunluğuna maruz kalan tüm birincil insan tipleri, görüntülenen canlı hücrelerin hipoksik olduğunu kanıtlayan güçlü yeşil floresan sergiledi.
İnsan beyni vasküler perisitlerini kuyu eklerinin abluminal tarafına tohumladıktan sonra, buharlaşmayı önlemek için bunları çevirme plakası ile örtmek çok önemlidir. Modelimizde, nispeten küçük, 0.4 mikrometre gözenek çapına sahip polyester kuyu ekleri kullanıyoruz, bu da tedavi için kan-beyin bariyerini geçmeyi gerektiren herhangi bir hastalığa ilaç adaylarının taranması için uygun hale getiriyor. Bu teknik, gerekirse proteinlerin ve taşıyıcıların modifikasyonunu görselleştirmek için mükemmel bir fırsat sağlar.
