Наш протокол признает необходимость лучшего повторения гематоэнцефалического барьера человека in vitro для изучения сложных клеточных механизмов, которые влияют на восстановление после инсульта. Наша тройная модель демонстрирует надежную целостность, которая частично связана с большим разделением скважин, что позволяет нам уменьшить частоту изменений и избежать разрушения популяций. Наша модель является отличным инструментом для изучения молекулярных и клеточных изменений, которые происходят на гематоэнцефалическом барьере во время и после ишемического инсульта.
Наш протокол позволяет открывать новые мишени и терапевтические средства для улучшения восстановления после инсульта. Современные методы лечения ишемического инсульта чувствительны ко времени и, следовательно, не всегда эффективны. Начните с культивирования HBVP в колбах для культивирования T75 с активированной поверхностью для адгезии клеток в инкубаторе диоксида углерода 5% при температуре 37 градусов Цельсия до слияния.
Как только слияние будет достигнуто, аспирируйте старую перицитную среду и промойте клетки пятью миллилитрами теплого PBS Дульбекко. Аспирируйте PBS Дульбекко и отделяйте клетки от колбы, используя комбинацию из четырех миллилитров теплого раствора трипсина ЭДТА и одного миллилитра PBS Дульбекко. Инкубируйте колбу в течение пяти минут при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе углекислого газа.
Посмотрите под микроскопом, чтобы убедиться, что клетки отделены от колбы. Добавьте в колбу пять миллилитров теплой перицитной среды, содержащей 2% FBS, и переложите отсоединенные ячейки в 50-миллилитровую центрифужную трубку. Центрифугируйте клеточную суспензию в течение трех минут по 200 г, позволяя клеткам образовывать гранулу в нижней части трубки.
Аспирируйте среду из трубки, гарантируя, что гранула ячейки останется неповрежденной. Повторно суспендировать клеточную гранулу в перицитной среде. Рассчитайте количество среды в зависимости от слияния ячеек и количества необходимых луночных вставок.
Возьмите 10 микролитров повторно взвешенных клеток, поместите их в слайд подсчета клеток и подсчитайте количество клеток. Определяют плотность клеток и семени 300 000 клеток на вставку в одном миллилитре перицитной среды на аблюминальной стороне колодезных вкладышей. Культивируют первичные астроциты человека, используя астроцитарную среду, содержащую 2% FBS, как описано в рукописи текста.
Определяют плотность клеток и выселяют 300 000 клеток на лунку на дно ткани культуры шестилуночными пластинами. Накройте пластину, чтобы предотвратить испарение, и инкубируйте в течение ночи. Аналогичным образом, культивируют HBMEC в блюдах для культивирования тканей, используя полную классическую среду, содержащую 10% FBS, как описано в текстовой рукописи.
Извлеките из инкубатора тканевую культуру шестилуночными пластинками, содержащими астроциты, и луночными вставками, содержащими перициты. Аспирировать астроцитарную среду из тканевой культуры шестилуночными пластинками и добавить в каждую лунку по одному миллилитру перицитной среды и по одному миллилитру астроцитарной среды. Аспирируйте перицитную среду из луночных вставок и поместите их в тканевую культуру шестилуночных пластинок, содержащих засеянные астроциты.
Посейте HBMEC при плотности 300 000 клеток на лунку в двух миллилитрах полной классической среды на апикальную сторону тех же луночных вставок. Трижды вымойте клетки PBS от Dulbecco. Для трехклеточных культур, подвергшихся кислородно-глюкозному депривации, добавляют бесглюковую среду как к апикальному, так и к базолатеральному компартментам.
Заменить питательную среду свежей средой и нормоксическими контрольными клеточными культурами. Поместите контрольные тройные культуры в инкубатор 5% углекислого газа при температуре 37 градусов Цельсия. Поместите чашку Петри, содержащую 20 миллилитров стерильной воды, в камеру инкубатора гипоксии, чтобы обеспечить адекватное увлажнение культур.
Откройте камеру, отпустив кольцевой зажим, затем расположите клеточные культуры на полках. Запечатайте камеру, закрепив кольцевой зажим. Откройте входное и выходное отверстия камеры и прикрепите трубку с верхней части расходомера камеры.
Прикрепите трубку от нижней части расходомера к бензобаку с помощью воздушного фильтра. Откройте клапан управления потоком резервуара, повернув его против часовой стрелки, чтобы обеспечить минимальный поток газа. Медленно откройте клапан регулятора давления, повернув по часовой стрелке.
Промывайте камеру газовой смесью в течение пяти минут со скоростью потока 20 литров в минуту. Отсоедините камеру от источника газа и плотно закройте оба белых пластиковых зажима. Выключите клапан управления потоком резервуара, повернув его по часовой стрелке.
Закройте клапан регулятора давления, повернув против часовой стрелки. Поместите камеру гипоксии в обычный инкубатор, установленный при 37 градусах Цельсия в течение четырех часов. Поместите стерилизованный инструмент TEER в шкаф биобезопасности и подключите электроды к эпителиальному вольтомометру.
Стерилизуйте электроды в 30 миллилитрах 70% раствора изопропилового спирта в течение минимум 30 минут. Включите прибор TEER и установите для функции значение Ом. Извлеките электроды из 70% раствора изопропилового спирта и поместите их в 20 миллилитров PBS Dulbecco в течение как минимум 30 минут, пока цифровое считывание на устройстве TEER не считывает ноль Ом.
Вставьте длинный зубец электрода через одно из трех отверстий в колодце вставки ангара заготовки скважины, опуская ее до тех пор, пока она не коснется дна скважины. Убедитесь, что короткий зубец покоится над верхушечной культурой на нижней части колодезной вставки. Подождите, пока значения цифрового считывания на приборе TEER выровняются, прежде чем записывать значение.
Поместите электроды обратно в PBS Dulbecco, чтобы промыть их между измерениями. Продолжайте собирать все измерения TEER для еще двух элементов управления вставками пустой скважины. Соберите измерения TEER на образцах пластин, как показано ранее.
После того, как все измерения были проведены, электрод возвращается в 70% раствор изопропилового спирта в течение 30 минут. Затем отсоедините электроды от прибора TEER и дайте им высохнуть на воздухе. Рассчитайте значения TEER.
Аспирировать среду из базолатерального компартмента и заменить ее двумя миллилитрами фенольной красной свободной среды роста эндотелиальных клеток в модели гематоэнцефалического барьера тройной клеточной культуры. Дважды промыть ячейки в апикальном отсеке с помощью HBSS. Добавьте один миллилитр раствора декстрана FITC в апикальный отсек и накройте пластину алюминиевой фольгой, затем поместите пластину в инкубатор, установленный при 37 градусах Цельсия с 5% углекислым газом в течение одного часа.
Возьмите 100 микролитров среды из базолатеральных отсеков и переложите ее в черную 96-луночную пластину. Измерьте флуоресценцию с помощью считывателя микропластин с длинами волн возбуждения и излучения, установленными на 480 и 530 нанометров соответственно. Семена 200 микролитров HBMEC, первичных астроцитов и HBVP в центре поли-D-лизина покрыты 35-миллиметровой стеклянной нижней посуды при плотности 150 000 клеток на блюдо.
Перед посевом HBMEC покройте дно посуды фактором крепления. Позвольте клеткам прикрепиться к стеклянной поверхности, оставив их на ночь при 37 градусах Цельсия в инкубаторе углекислого газа. Как только слияние будет достигнуто, отбросьте культуральную среду и добавьте два миллилитра предварительно нагретой среды без глюкозы для кислородно-глюкозного голодания или нормальной среды для контрольной группы.
После кислородно-глюкозной депривации замените среду оптимизированной для визуализации средой во всех чашках, затем выполните флуоресцентную визуализацию живых клеток с помощью фильтра GFP и инкубатора конфокального микроскопа верхней ступени, как описано в текстовой рукописи. Барьерную целостность эндотелиального монослоя в указанных конфигурациях модели гематоэнцефалического барьера оценивали путем определения TEER до и после кислородно-глюкозной депривации, а также после 24 часов реоксигенации. В течение четырех часов кислородно-глюкозная депривация вызывала значительное снижение значений TEER только в монокультуре HBMEC и модели кокультуры с HBMEC и HBVP.
Эти сниженные уровни достигли исходных уровней после 24 часов повторной оксигенации. Значения TEER в модели тройной кокультуры были значительно выше, чем в контроле двойной кокультуры или контроле монокультуры сразу после кислородно-глюкозного депривации. Параклеточная проницаемость эндотелиальных монослоев до 20 килодалтонной молекулярной массы, декстрана FITC, была резко увеличена в монокультуре HBMEC и в меньшей степени в модели кокультуры с HBMEC и HBVP по сравнению с нормоксическим контролем.
Кроме того, уровни проницаемости декстрана FITC в 20 килодалтонов были самыми низкими в модели тройного мозгового барьера среди всех моделей в условиях нормоксической и кислородно-глюкозной депривации. Ни в одной из моделей не наблюдалось никаких изменений в потоке декстрана FITC через эндотелиальные монослои. Все первичные типы людей, подвергшиеся кислородно-глюкозной депривации, демонстрировали сильную зеленую флуоресценцию, доказывая, что изображенные живые клетки были гипоксическими.
После посева сосудистых перицитов головного мозга человека на аблюминальную сторону колодезных вкладышей очень важно накрыть их откидной пластиной, чтобы предотвратить испарение. В нашей модели мы используем относительно небольшой диаметр пор 0,4 микрометра полиэфирных луночных вставок, что делает его пригодным для скрининга кандидатов на лекарства при любом заболевании, которое требует пересечения гематоэнцефалического барьера для лечения. Эта методика дает прекрасную возможность визуализировать модификацию белков и транспортеров при необходимости.
