Nosso protocolo reconhece a necessidade de recapitular melhor a barreira hematoencefálica humana in vitro para o estudo de mecanismos celulares complexos que afetam a recuperação pós-acidente vascular cerebral. Nosso modelo triplo exibe integridade robusta, que está parcialmente relacionada à grande compartimentação de inserções de poços, permitindo-nos diminuir a frequência de mudança e evitar a interrupção das populações. Nosso modelo é uma ótima ferramenta para estudar as alterações moleculares e celulares que ocorrem na barreira hematoencefálica durante e após o acidente vascular cerebral isquêmico.
Nosso protocolo permite a descoberta de novos alvos e terapias para melhorar a recuperação pós-AVC. Os tratamentos atuais para o AVC isquêmico são sensíveis ao tempo e, consequentemente, nem sempre são eficazes. Comece cultivando HBVP em frascos de cultura T75 com uma superfície ativada para adesão celular dentro de uma incubadora de dióxido de carbono a 5% a 37 graus Celsius até ficar confluente.
Uma vez atingida a confluência, aspirar o meio pericitário antigo e lavar as células com cinco mililitros de PBS de Dulbecco quente. Aspirar o PBS de Dulbecco e separar as células do balão utilizando uma combinação de quatro mililitros de solução quente de tripsina EDTA e um mililitro de PBS de Dulbecco. Incubar o balão durante cinco minutos a 37 graus Celsius numa incubadora de dióxido de carbono.
Vista ao microscópio para confirmar se as células estão separadas do balão. Adicionar cinco mililitros de meio de perícito quente contendo 2%FBS ao balão e transferir as células destacadas para um tubo de centrífuga de 50 mililitros. Centrifugar a suspensão celular por três minutos a 200 g, permitindo que as células formem uma pelota no fundo do tubo.
Aspirar o meio do tubo garantindo que o pellet da célula permaneça intacto. Ressuspeite o pellet celular em meio pericito. Calcule a quantidade de meio dependendo da confluência das células e do número de inserções de poço necessárias.
Pegue 10 microlitros das células ressuspensas, coloque-as em uma lâmina de contagem de células e conte o número de células. Determinar a densidade celular e semear 300.000 células por inserção em um mililitro de meio pericitário no lado abluminal das inserções do poço. Cultive astrócitos humanos primários usando o meio astrócitos contendo 2%FBS, conforme descrito no manuscrito do texto.
Determine a densidade celular e semeie 300.000 células por poço no fundo das placas de seis poços de cultura de tecidos. Cubra a placa para evitar a evaporação e incube durante a noite. Da mesma forma, cultive HBMEC em placas de cultura de tecidos usando meio clássico completo contendo 10% de FBS, conforme descrito no manuscrito do texto.
Retire as placas de seis poços de cultura de tecidos contendo astrócitos e as inserções de poço contendo pericitos da incubadora. Aspirar o meio astrócitos das placas de seis poços de cultura de tecidos e adicionar um mililitro de meio pericitário e um mililitro de meio astrócitos a cada poço. Aspirar o meio pericitário das inserções do poço e colocá-los na cultura de tecidos de seis placas de poços contendo os astrócitos semeados.
Semente HBMEC a uma densidade de 300.000 células por poço em dois mililitros de meio clássico completo no lado apical do mesmo poço insere . Lave as células três vezes com PBS de Dulbecco. Para culturas de células triplas submetidas à privação de oxigênio-glicose, adicionar meio livre de glicose aos compartimentos apical e basolateral.
Substitua o meio de cultura por meio fresco e culturas de células de controle normóxico. Coloque as culturas triplas de controle na incubadora de dióxido de carbono a 5% a 37 graus Celsius. Coloque uma placa de Petri contendo 20 mililitros de água estéril na câmara incubadora de hipóxia para fornecer umidificação adequada das culturas.
Abra a câmara soltando a braçadeira do anel e, em seguida, organize as culturas de células nas prateleiras. Sele a câmara prendendo a braçadeira do anel. Abra as portas de entrada e saída da câmara e prenda a tubulação da parte superior do medidor de vazão da câmara.
Anexe a tubulação da parte inferior do medidor de vazão ao tanque de gás através de um filtro de ar. Abra a válvula de controle de fluxo do tanque girando-a no sentido anti-horário para permitir o fluxo mínimo de gás. Abra lentamente a válvula reguladora de pressão girando no sentido horário.
Lavar a câmara com a mistura de gases durante cinco minutos a um caudal de 20 litros por minuto. Desconecte a câmara da fonte de gás e feche ambas as braçadeiras de plástico branco com firmeza. Desligue a válvula de controle de fluxo do tanque girando no sentido horário.
Feche a válvula reguladora de pressão girando no sentido anti-horário. Coloque a câmara de hipóxia em uma incubadora convencional a 37 graus Celsius por quatro horas. Coloque o instrumento TEER esterilizado no gabinete de biossegurança e conecte os eletrodos ao medidor epitelial de volt ohm.
Esterilizar os eletrodos em 30 mililitros de solução de álcool isopropílico a 70% por um período mínimo de 30 minutos. Ligue o instrumento TEER e defina a função como ohms. Remova os eléctrodos da solução de álcool isopropílico a 70% e coloque-os em 20 mililitros de PBS da Dulbecco durante um mínimo de 30 minutos até que a leitura digital no dispositivo TEER leia zero ohms.
Insira o pino longo do eletrodo através de uma das três aberturas no hangar de inserção do poço do controle de inserção do poço em branco abaixando-o até que ele toque o fundo do poço. Certifique-se de que o pino curto esteja descansando acima da cultura apical na parte inferior da inserção do poço. Aguarde até que os valores de leitura digital no instrumento TEER se estabilizem antes de registrar o valor.
Coloque os eletrodos de volta no PBS da Dulbecco para lavá-los entre as medições. Continue a coletar todas as medições TEER para mais dois controles de inserção de poço em branco. Coletar as medições TEER das placas de amostragem, conforme demonstrado anteriormente.
Uma vez que todas as medições tenham sido realizadas, o eletrodo de volta para a solução de álcool isopropílico a 70% por 30 minutos. Em seguida, desconecte os eletrodos do instrumento TEER e deixe-os secar ao ar. Calcule os valores TEER.
Aspirar o meio do compartimento basolateral e substituí-lo por dois mililitros de meio de crescimento de células endoteliais livres de vermelho fenol no modelo de barreira hematoencefálica de cultura de células triplas. Lave as células no compartimento apical duas vezes com HBSS. Adicione um mililitro da solução de dextran FITC no compartimento apical e cubra a placa com papel alumínio, em seguida, coloque a placa no conjunto da incubadora a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por uma hora.
Pegue 100 microlitros de meio dos compartimentos basolaterais e transfira-o para uma placa preta de 96 poços. Meça a fluorescência usando um leitor de microplacas com a excitação e os comprimentos de onda de emissão ajustados para 480 e 530 nanômetros, respectivamente. Semear 200 microlitros de HBMEC, astrócitos primários e HBVP no centro de placas de fundo de vidro revestidas de poli-D revestidas de 35 milímetros a uma densidade de 150.000 células por prato.
Antes de semear HBMEC, cubra o fundo dos pratos com o fator de fixação. Permita que as células se liguem à superfície do vidro, deixando-as durante a noite a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono. Uma vez atingida a confluência, descarte o meio de cultura e adicione dois mililitros de meio livre de glicose pré-aquecido para privação de oxigênio-glicose ou meio normal para controles.
Após o tratamento de privação de oxigênio-glicose, substitua o meio pelo meio otimizado de imagem em todas as placas e, em seguida, realize imagens de células vivas de fluorescência com o filtro GFP e a incubadora de microscópio confocal de estágio superior, conforme descrito no manuscrito do texto. A integridade da barreira da monocamada endotelial nas configurações indicadas do modelo de barreira hematoencefálica foi avaliada por meio da determinação do TEER antes e após as privações de oxigênio-glicose, bem como após 24 horas de reoxigenação. Durante quatro horas, a privação de oxigênio-glicose causou uma diminuição significativa nos valores de TEER apenas na monocultura do HBMEC e no modelo de co-cultura com HBMEC e HBVP.
Esses níveis diminuídos atingiram os níveis basais após 24 horas de reoxigenação. Os valores de TEER no modelo de cocultura tripla foram significativamente maiores do que os dos controles de cocultura dupla ou controle de monocultura imediatamente após a privação de oxigênio-glicose. A permeabilidade paracelular das monocamadas endoteliais à massa molecular de 20 quilodaltons, FITC dextrano, foi drasticamente aumentada na monocultura HBMEC e, em menor grau, no modelo de co-cultura com HBMEC e HBVP em comparação com controles normóxicos.
Além disso, os níveis de permeabilidade ao dextrano FITC de 20 quilodaltons foram os mais baixos no modelo de barreira cérebro-sangue tripla entre todos os modelos sob condições normóxicas e de privação de oxigênio-glicose. Não foram observadas alterações no fluxo de 70 quilodaltons, FITC dextran através das monocamadas endoteliais em nenhum dos modelos. Todos os tipos humanos primários expostos à privação de oxigênio-glicose exibiram forte fluorescência verde, provando que as células vivas fotografadas eram hipóxicas.
Depois de semear os pericitos vasculares do cérebro humano no lado abluminal das inserções de poços, é muito importante cobri-los com a placa de inversão para evitar a evaporação. Em nosso modelo, usamos um diâmetro de poro relativamente pequeno, de 0,4 micrômetro, de inserções de poços de poliéster, tornando-o adequado para a triagem de candidatos a medicamentos para qualquer doença que exija a travessia da barreira hematoencefálica para tratamento. Esta técnica oferece uma excelente oportunidade para visualizar a modificação de proteínas e transportadores, se necessário.
