阐明植物中2,4-二溴苯酚的代谢

植物愈伤组织培养为准确、高效、快速地评估植物中异生素的代谢降解提供了解决方案。植物愈伤组织培养可以排除微生物组或真菌干扰和光化学降解，简化完整植物的基质效应，规范栽培条件，缩短处理时间，需要较少的实验工作。本文提出的方法可以深入了解不同有机污染物对作物的吸收行为和代谢机制，有助于环境风险评估。

首先，高压灭菌所有设备并在紫外线灭菌的超净工作台中执行所有操作。用75%乙醇对春化的种子表面消毒20分钟。用无菌去离子水冲洗三次，然后再次用20%过氧化氢消毒20分钟。

用灭菌的去离子水洗涤种子六次后，通过在含有1%琼脂凝胶的pH 5.8的高压灭菌，无激素的Murashige和Skoog培养基上无菌发芽，并在26摄氏度下孵育16小时光期15天。种子孵育15天后，将幼苗的下胚轴和子叶切成0.5厘米的小块，得到外植体。在含有 15 至 20 毫升补充有 Oxymon 和藻蓝蛋白的高压灭菌 Murashige 和 Skoog 培养基的培养皿中转化外植体，并在 26 摄氏度的黑暗中孵育三到四周以诱导愈伤组织。

使用无菌手术刀和镊子，分离由初始外植体形成的约一厘米直径的愈伤组织。为了进行处理，将2,4-二溴苯酚溶解在10毫升无菌液体Murashige和Skoog培养基中。然后将三克分离的胡萝卜愈伤组织加入制备的2,4-二溴苯酚溶液中。

按照手稿中所述在空白对照中制备培养基后，将所有烧瓶在黑暗中孵育。为了制备样品，用0.45微米玻璃纤维过滤器过滤，将愈伤组织与2,3-二溴苯酚处理和对照烧瓶小心分离。收集前用超纯水清洗愈伤组织三次。

冷冻干燥所有收集的愈伤组织，并用 0.2 赫兹的高通量组织研磨机将 70 克干愈伤组织匀浆三分钟。使用玻璃微量注射器将50微升替代物氘代4-n-纳米苯酚加入均质愈伤组织中并涡旋一分钟。向加标愈伤组织中加入含有等比例甲醇和水的溶液5毫升，超声处理30分钟，以提取2,4-二溴苯酚和代谢物。

提取后，将悬浮液在4摄氏度下以8， 000G离心10分钟，并通过移液收集上清液。将提取物以每分钟一毫升的流速通过亲水亲脂性平衡固相萃取或HLB-SPE滤芯。通过将6毫升甲醇通过HLB-SPE柱来稀释分析物。

然后将获得的淋洗液在温和的氮气流下浓缩至一毫升，用于仪器分析。为了进行分析，打开色谱柱加热器门。然后通过将色谱柱入口连接到进样阀并将出口连接到质谱仪的入口来安装超高效液相色谱柱。

将溶剂管A和B的末端插入相应的溶剂瓶中。按序列号将样品瓶放置在样品盘的相应位置，然后将样品托盘重新插入样品室。在软件窗口中，单击仪器，然后单击进样方法以编辑液相色谱图的条件。

选择MS方法并设置质谱分析参数。单击“文件”，然后单击“新建”以创建并命名数据库。加载上面创建的示例程序，方法是选择 MS 文件，然后选择入口文件和注入体积。

通过单击“文件并保存”将数据库保存在项目的示例文件夹中。接下来，在主软件窗口中选择运行并启动，然后单击获取样本数据，然后单击开始样本列表中的确定按钮运行以收集数据。要处理数据，请选择目标数据行，然后单击色谱图窗口以查看MS扫描色谱图。

在色谱图中，单击显示，然后单击TIC。单击扫描波DS后，添加迹线和确定以获取子质谱扫描。与对照样品相比，2,4-二溴苯酚处理的胡萝卜愈伤组织提取物的色谱图显示存在八种不同的代谢物。

此外，色谱图中没有母体2,4-二溴苯酚峰表明在实验条件下胡萝卜愈伤组织中2,4-二溴苯酚的快速代谢。此外，在胡萝卜愈伤组织中孵育的2,4-二溴苯酚通过与葡萄糖和氨基酸直接结合导致代谢物的形成。所有设备以及Murashige和Skoog培养基都应进行高压灭菌，以确保植物愈伤组织的差异化和维护在无菌条件下进行。

遵循该程序的组学方法允许创建环境污染物的清晰植物毒性机制图。