该协议描述了一种将人类IPC分化为复杂的三维神经视网膜类器官以进行研究和再生应用的简单有效的方法。该技术涉及贴壁和悬浮培养，允许选择性挑选和富集视网膜类器官和RP细胞。它可以为开发基于细胞的视网膜退行性疾病疗法提供可行且定期的细胞源供应。
这种干细胞来源的视网膜类器官和RPE细胞可作为体外模型用于研究眼睛发育和遗传性视网膜疾病。这种方法可以很容易地被已经熟悉处理人类IPSC培养物的研究实验室复制。视觉演示极大地支持了眼野的识别和基于其空间定位和形态特征的神经视网膜杯的分离。
首先，在六孔板中吸出70%至80%融合的人IPSC培养物的用过的培养基。将PBS添加到孔中，旋转它们并吸出洗涤缓冲液。然后向每个孔中加入一毫升细胞解离溶液或CDS，并将板在37摄氏度下孵育五到七分钟，直到细胞四舍五入。
吸出CDS并将细胞悬液收集到15毫升离心管中。在室温下以 1， 000 RPM 旋转管子四分钟。弃去上清液并将细胞沉淀重悬于1.2毫升Essential 8培养基中。
将200微升细胞悬液分配到含有1.5毫升IPSC培养基和10微摩尔Y27632的基质包被的六孔板的每个孔中。12至24小时后，除去用过的培养基并加入不含Y27632的预热完全提升培养基以维持培养物。每24小时更换一次培养基，直到培养物达到70%至80%汇合度。
在第零天，吸出人IPSC维持培养基，并向六孔板中加入含有每毫升BFGF一毫微克和每毫升Noggin一毫微克的分化诱导培养基。将细胞在37摄氏度下在5%二氧化碳培养箱中孵育。在第一天，吸出用过的培养基并加入含有每毫升 1 纳克 BFGF 和 10 纳克/毫升 Noggin 的分化诱导培养基。
在37摄氏度的5%二氧化碳培养箱中再次孵育细胞。在第 2 天和第 3 天，取出用过的培养基并加入含有每毫升 10 ngg Noggin 的分化诱导培养基。将每孔培养基加入两毫升到六孔板后，将细胞在37摄氏度下在5%二氧化碳培养箱中孵育，每24小时更换一次培养基。
在第四天，去除用过的培养基并添加视网膜分化培养基或RDM。按照相同的步骤将每孔培养基加入两毫升到六孔板中并孵育培养物。每天更换培养基。
在第14天和第18天左右，在显微镜下以10倍放大倍率观察培养物，以发现由早期眼野祖细胞组成的神经莲座状结构域的出现。在第 21 天和第 28 天左右，在显微镜下以 4X 和 10X 放大倍率观察培养物的出现，以观察自组织的不同 EFP 的出现，其中心岛由圆形 3D 神经视网膜结构组成，周围环绕着连续的神经上皮和眼表上皮生长。取无菌巴斯德移液管，一只手握住底座，另一只手握住毛细管尖端。
通过旋转运动对毛细管尖端中间附近的区域进行火焰消毒和加热，直到玻璃变得柔韧。然后远离火焰，迅速向外拉毛细管尖端，形成具有封闭管腔的细毛细管尖端。将细尖端水平握在火焰前面，然后以向外运动快速通过火焰，以形成光滑的钩子或 L 形毛细管尖端。
在体视显微镜下，使用毛细管钩的光滑外曲率区作为细勺，从各个EFP中手动挑选形状良好的神经视网膜杯。在第 25 天和第 30 天，在低附着 60 毫米培养皿中加入 4 毫升预热的视网膜分化培养基，以培养和维持视网膜杯以生成 3D 视网膜类器官。这应该在收获神经视网膜杯之前完成。
将一毫米微量移液器设置为吸出 100 微升，并使用具有宽孔开口的一毫升微量吸头吸出并将浮动视网膜杯转移到之前准备的新鲜低贴壁培养皿中。将视网膜杯保持在RDM中作为非贴壁悬浮培养物，并在37%二氧化碳培养箱中以37摄氏度孵育它们。在第30天和第45天，遵循部分进料方法，去除一半体积的废培养基，并用等体积的新鲜培养基代替。
在第45天和第60天，在含有100微摩尔牛磺酸的RDM中再培养视网膜类器官两周，以支持神经视网膜祖细胞的更好存活和谱系分化以及成熟视网膜细胞类型的发育。视网膜类器官在不同的成熟阶段表征，用于使用RT-PCR和免疫组织化学表达几种视网膜祖细胞标志物。RT-PCR结果证实了一个月大的视网膜类器官和两个月大的视网膜类器官中神经视网膜标志物的诱导和表达。
此处显示了使用针对神经视网膜祖细胞标志物 Chx10、PAX6 和 Otx2 的抗体的未成熟视网膜类器官的免疫标记切片的共聚焦图像，以及使用针对感光器前体标志物恢复蛋白和 CRX 的抗体的成熟视网膜类器官的共聚焦图像。具有分化感光细胞的视网膜类器官的标记外层被放大并显示在这些图像中。基本的内段状延伸部分用白色箭头标记。
以神经视网膜罩为中心且迁移的 RPE 生长物的 EFP 簇沿前缘显示色素沉着。此处显示了神经视网膜岛周围多个EFP的分化良好的色素上皮生长。EFP 的较高放大倍率显示 RPE 祖细胞的迁移区和神经视网膜杯周围的眼表上皮。
此处显示了发展出含有色素和非色素细胞的未成熟RPE细胞单层的扩展贴壁培养物。完全成熟和色素沉着的RPE细胞的单层培养物在第60天显示出鹅卵石形态。表达PAX6，MITF和RPE65的RPE细胞如图所示。
这些图像代表具有异常聚集体的视网膜祖细胞的EFP，具有扭曲的层压和缺乏条纹。EFP与微型神经视网膜杯，但缺乏RPE和眼表上皮的周围区域如图所示。代表性图像显示了悬浮培养物中形成的不规则神经视网膜聚集体。
使用接近融合的IPC培养物开始分化过程非常重要，以便在三到四周内实现眼野的有效诱导。由正常和患者特异性IPC产生的视网膜类器官和RPE细胞可用作视网膜疾病模型和测试新型治疗药物。
