Ce protocole décrit une méthode simple et efficace de différenciation des CPI humaines en organoïdes neurorétiniens tridimensionnels complexes pour la recherche et les applications régénératives. Cette technique implique à la fois des cultures adhérentes et des cultures en suspension, ce qui permet une cueillette sélective et un enrichissement des organoïdes rétiniens et des cellules RP. Il peut offrir un approvisionnement viable et régulier de sources cellulaires pour le développement de thérapies cellulaires pour les maladies dégénératives de la rétine.
Ces organoïdes rétiniens dérivés de cellules souches et les cellules EPR sont utiles comme modèles in vitro pour étudier le développement oculaire et les maladies rétiniennes héréditaires. Cette méthode peut être facilement reproduite par les laboratoires de recherche qui sont déjà familiers avec la manipulation des cultures IPSC humaines. La démonstration visuelle soutient grandement l’identification des champs oculaires et l’isolement des cupules neuro-rétiniennes en fonction de leur positionnement spatial et de leurs caractéristiques morphologiques.
Pour commencer, aspirez le milieu usé de 70 à 80% de cultures IPSC humaines confluentes dans des plaques à six puits. Ajouter du PBS aux puits, les faire tourbillonner et aspirer le tampon de lavage. Ajoutez ensuite un millilitre de solution de dissociation cellulaire ou de CDS à chaque puits et incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant cinq à sept minutes jusqu’à ce que les cellules s’arrondissent.
Aspirer le CDS et recueillir la suspension cellulaire dans un tube centrifuge de 15 millilitres. Faites tourner le tube à 1 000 tr/min pendant quatre minutes à température ambiante. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille de cellule dans 1,2 millilitre de milieu Essential 8.
Distribuer 200 microlitres de la suspension cellulaire dans chaque puits d’une plaque de six puits revêtue de matrice contenant 1,5 millilitre de milieu de culture IPSC et 10 micromolaires Y27632. Après 12 à 24 heures, retirer le milieu épuisé et ajouter le milieu d’ascension complet préchauffé sans Y27632 pour maintenir les cultures. Changez le milieu de culture toutes les 24 heures jusqu’à ce que les cultures atteignent 70 à 80% de confluence.
Le jour zéro, aspirez le milieu de maintenance IPSC humain et ajoutez un milieu d’induction de différenciation contenant un nanogramme par millilitre BFGF et un nanogramme par millilitre de Noggin à la plaque à six puits. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius dans un incubateur de dioxyde de carbone à 5%. Le premier jour, aspirez le milieu usé et ajoutez un milieu d’induction de différenciation contenant un nanogramme par millilitre BFGF et 10 nanogrammes par millilitre Noggin.
Incuber à nouveau les cellules à 37 degrés Celsius dans un incubateur à 5% de dioxyde de carbone. Les deuxième et troisième jours, retirez le milieu usé et ajoutez le milieu d’induction de différenciation contenant 10 nanogrammes par millilitre de Noggin. Après avoir ajouté deux millilitres par milieu de puits à une plaque de six puits, incuber les cellules à 37 degrés Celsius dans un incubateur de dioxyde de carbone à 5% et changer le milieu toutes les 24 heures.
Le quatrième jour, retirez le milieu usé et ajoutez le milieu de différenciation rétinienne ou RDM. Suivez la même procédure pour ajouter deux millilitres par milieu de puits à une plaque de six puits et pour incuber les cultures. Changez le support tous les jours.
Vers les jours 14 et 18, observez les cultures au microscope à un grossissement de 10X pour l’émergence de domaines neuronaux ressemblant à des rosettes constitués de progéniteurs précoces du champ oculaire. Vers les jours 21 et 28, observer les cultures au microscope à un grossissement de 4X et 10X pour observer l’émergence d’EFP distincts auto-organisés avec un îlot central de structures neurorétiniennes circulaires 3D entourées d’excroissances contiguës de neuroépithélium et d’épithélium de surface oculaire. Prenez une pipette Pasteur stérile et tenez la base dans une main et l’extrémité capillaire dans l’autre.
Stérilisez à la flamme et chauffez la région près du milieu de l’extrémité capillaire avec des mouvements de rotation jusqu’à ce que le verre devienne souple. Ensuite, éloignez-vous de la flamme et tirez rapidement l’extrémité capillaire vers l’extérieur pour créer une pointe capillaire fine avec une lumière fermée. Tenez la pointe fine horizontalement devant la flamme et passez-la rapidement à travers la flamme dans un mouvement vers l’extérieur pour créer un crochet lisse ou une pointe capillaire en forme de L.
Sous un stéréomicroscope, prélever manuellement les cupules neuro-rétiniennes bien formées dans les EFP individuels en utilisant la zone de courbure externe lisse du crochet capillaire comme une cuillère fine. Aux jours 25 et 30, ajouter quatre millilitres de milieu de différenciation rétinienne préchauffé dans une boîte de 60 millimètres à faible attachement à la culture et maintenir les cupules rétiniennes pour générer des organoïdes rétiniens 3D. Cela devrait être fait avant de récolter les cupules neuro rétiniennes.
Réglez une micropipette d’un millimètre pour aspirer 100 microlitres et utilisez des micropointes d’un millilitre avec des ouvertures de large alésage pour aspirer et transférer les tasses rétiniennes flottantes dans les plats frais de culture à faible adhérence préparés plus tôt. Maintenir les cupules rétiniennes dans le RDM sous forme de cultures de suspension non adhérentes et les incuber à 37 degrés Celsius dans un incubateur de dioxyde de carbone à 5%. Les jours 30 et 45, en suivant une méthode d’alimentation partielle, retirer la moitié du volume du milieu usé et le remplacer par un volume égal de milieu frais.
Les jours 45 et 60, culture des organoïdes rétiniens pendant deux semaines supplémentaires dans un RDM contenant 100 taurine micromolaire pour soutenir une meilleure survie et différenciation de la lignée des progéniteurs neuro-rétiniens et le développement de types de cellules rétiniennes matures. Les organoïdes rétiniens sont caractérisés à différents stades de maturation pour l’expression de plusieurs marqueurs progéniteurs rétiniens par RT-PCR et immunohistochimie. Les résultats de la RT-PCR ont confirmé l’induction et l’expression de marqueurs neurorétiniens dans les organoïdes rétiniens âgés d’un mois et les organoïdes rétiniens âgés de deux mois.
Les images confocales de coupes immunomarquées d’organoïdes rétiniens immatures utilisant des anticorps contre les marqueurs progéniteurs neurorétiniens Chx10, PAX6 et Otx2, et d’organoïdes rétiniens matures utilisant des anticorps contre les marqueurs précurseurs photorécepteurs recoverin et CRX sont présentées ici. La couche la plus externe marquée des organoïdes rétiniens avec des cellules photoréceptrices différenciantes est zoomée et montrée dans ces images. Les extensions internes rudimentaires en forme de segment sont marquées par des flèches blanches.
Les grappes EFP avec la coupe neuro-rétinienne au centre et les excroissances RPE migrantes montrent une pigmentation le long des bords d’attaque. Des excroissances épithéliales pigmentées bien différenciées provenant de multiples PFE tout autour de l’île neurorétinienne sont montrées ici. Un grossissement plus élevé d’une PFE montre la zone migratoire des progéniteurs de l’EPR et de l’épithélium de surface oculaire entourant une coupe neurorétinienne.
Les cultures adhérentes étendues qui ont développé des monocouches de cellules EPR immatures contenant à la fois des cellules pigmentées et non pigmentées sont présentées ici. Les cultures monocouches de cellules RPE complètement matures et pigmentées montrent une morphologie pavée au jour 60. Les cellules RPE exprimant PAX6, MITF et RPE65 sont illustrées dans cette figure.
Ces images représentent des EFP avec des agrégats anormaux de progéniteurs rétiniens avec un laminage déformé et un manque de stries . EFP avec la coupe neuro rétinienne miniature, mais dépourvue de la zone environnante de RPE et de l’épithélium de surface oculaire sont montrés dans cette figure. L’image représentative montre des agrégats neurorétiniens irréguliers formés dans la culture de suspension.
Il est très important de commencer le processus de différenciation en utilisant des cultures de CPI en croissance quasi confluente pour obtenir une induction efficace des champs oculaires dans les trois à quatre semaines. Les organoïdes rétiniens et les cellules EPR générées à partir de CPI normales et spécifiques au patient peuvent être utilisés comme modèles de maladies rétiniennes et pour tester de nouveaux médicaments thérapeutiques.
