이 프로토콜은 연구 및 재생 응용 분야를 위해 인간 IPC를 복잡한 3차원 신경 망막 오가노이드로 구별하는 간단하고 효율적인 방법을 설명합니다. 이 기술은 부착 배양과 현탁 배양을 모두 포함하며, 이를 통해 망막 오가노이드와 RP 세포 모두를 선택적으로 선별하고 농축할 수 있습니다. 망막 퇴행성 질환에 대한 세포 기반 치료법을 개발하기 위한 세포 공급원의 실행 가능하고 규칙적인 공급을 제공할 수 있습니다.
이러한 줄기세포 유래 망막 오가노이드 및 RPE 세포는 눈 발달 및 유전성 망막 질환을 연구하기 위한 in vitro 모델로 유용하다. 이 방법은 이미 인간 IPSC 배양을 다루는 데 익숙한 연구실에서 쉽게 복제할 수 있습니다. 시각적 시연은 안구 식별과 공간적 위치 및 형태학적 특징을 기반으로 하는 신경 망막 컵의 분리를 크게 지원합니다.
먼저, 6-웰 플레이트에서 70 내지 80%의 인간 IPSC 배양물을 흡인한다. PBS를 웰에 넣고 소용돌이 치고 세척 버퍼를 흡인합니다. 그런 다음 1 밀리리터의 세포 해리 용액 또는 CDS를 각 웰에 넣고 세포가 반올림 될 때까지 섭씨 37도에서 5-7 분 동안 플레이트를 배양합니다.
CDS를 흡인하고 세포 현탁액을 15밀리리터 원심분리기 튜브에 수집합니다. 실온에서 4 분 동안 1, 000 RPM으로 튜브를 회전시킵니다. 상청액을 버리고 세포 펠릿을 1.2 밀리리터의 Essential 8 배지에 재현탁합니다.
200 마이크로리터의 세포 현탁액을 1.5 밀리리터의 IPSC 배양 배지 및 10 마이크로몰 Y27632를 함유하는 매트릭스-코팅된 6-웰 플레이트의 각 웰 내로 분배한다. 12 내지 24시간 후, 사용한 배지를 제거하고, Y27632 없이 예열된 완전한 상승 배지를 첨가하여 배양물을 유지한다. 배양이 70 내지 80% 합류에 도달할 때까지 24시간마다 배양 배지를 교체한다.
0일째에 인간 IPSC 유지 배지를 흡인하고 밀리리터 BFGF당 1나노그램 및 밀리리터당 1나노그램 노긴을 포함하는 분화 유도 배지를 6웰 플레이트에 추가합니다. 섭씨 37도의 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 세포를 배양합니다. 첫째 날에, 소비 된 배지를 흡인하고 밀리 리터 BFGF 당 1 나노 그램 및 밀리리터 당 10 나노 그램 Noggin을 포함하는 분화 유도 배지를 추가하십시오.
섭씨 37도의 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 세포를 다시 배양합니다. 2 일과 3 일째에 사용 된 배지를 제거하고 밀리 리터 당 10 나노 그램 Noggin을 함유 한 분화 유도 배지를 첨가하십시오. 6 웰 플레이트에 웰 배지 당 2 밀리리터를 첨가 한 후, 5 % 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37 도의 세포를 배양하고 24 시간마다 배지를 교체한다.
4일째에 사용한 배지를 제거하고 망막 분화 배지 또는 RDM을 추가합니다. 동일한 절차에 따라 웰 배지 당 2 밀리리터를 6 웰 플레이트에 첨가하고 배양물을 배양합니다. 매일 매체를 변경하십시오.
14일과 18일쯤에 초기 안구 전구체로 구성된 신경 로제트 유사 영역의 출현을 위해 10X 배율로 현미경으로 배양을 관찰합니다. 21일과 28일경에 4X 및 10X 배율로 현미경으로 배양을 관찰하여 신경 상피와 안구 표면 상피의 연속적인 파생물로 둘러싸인 원형 3D 신경 망막 구조의 중심 섬을 가진 자가 조직화된 별개의 EFP의 출현을 관찰합니다. 멸균 파스퇴르 피펫을 가지고 한 손에는 베이스를, 다른 한 손에는 모세관 끝을 잡습니다.
유리가 유연해질 때까지 회전 운동으로 모세관 끝의 중간 근처 영역을 화염 살균하고 가열합니다. 그런 다음 화염에서 멀어지고 모세관 끝을 바깥쪽으로 빠르게 당겨 닫힌 내강이 있는 미세한 모세관 끝을 만듭니다. 가는 팁을 화염 앞에서 수평으로 잡고 바깥쪽으로 빠르게 화염을 통과시켜 부드러운 후크 또는 L자형 모세관 팁을 만듭니다.
실체 현미경으로 모세관 후크의 부드러운 외부 곡률 영역을 미세한 스쿱으로 사용하여 개별 EFP에서 잘 형성된 신경 망막 컵을 수동으로 선택합니다. 25일과 30일에 4밀리리터의 미리 예열된 망막 분화 배지를 낮은 부착 60mm 접시에 넣고 배양하고 3D 망막 오가노이드를 생성하기 위한 망막 컵을 유지합니다. 이것은 신경 망막 컵을 채취하기 전에 수행해야 합니다.
100마이크로리터를 흡인하기 위해 1밀리미터 마이크로피펫을 설정하고 넓은 구멍이 있는 1밀리리터 마이크로 팁을 사용하여 떠 있는 망막 컵을 흡인하고 이전에 준비한 신선한 저부착성 배양 접시에 옮깁니다. RDM의 망막 컵을 비부착성 현탁액 배양으로 유지하고 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 배양합니다. 30 일과 45 일에 부분 공급 방법에 따라 소비 된 배지의 부피를 절반으로 제거하고 동일한 양의 신선한 배지로 교체하십시오.
45일과 60일에 신경 망막 전구체의 더 나은 생존과 계통 분화 및 성숙한 망막 세포 유형의 발달을 지원하기 위해 100마이크로몰 타우린을 함유한 RDM에서 추가로 2주 동안 망막 오가노이드를 배양합니다. 망막 오가노이드는 RT-PCR 및 면역조직화학을 사용하여 여러 망막 전구 마커의 발현을 위해 다양한 성숙 단계에서 특성화됩니다. RT-PCR 결과는 생후 1개월령의 망막 오가노이드와 생후 2개월령의 망막 오가노이드에서 망막 신경 마커의 유도 및 발현을 확인하였다.
신경 망막 전구체 마커 Chx10, PAX6 및 Otx2에 대한 항체를 사용하는 미성숙 망막 오가노이드의 면역 표지 섹션과 광수용체 전구체 마커 recoverin 및 CRX에 대한 항체를 사용하는 성숙 망막 오가노이드의 공초점 이미지가 여기에 표시됩니다. 분화 광수용체 세포가 있는 망막 오가노이드의 표시된 가장 바깥쪽 층이 확대되어 이 이미지에 표시됩니다. 기본적인 내부 세그먼트와 같은 확장은 흰색 화살표로 표시됩니다.
중앙에 신경 망막 컵이 있고 이동하는 RPE 파생물이 있는 EFP 클러스터는 앞쪽 가장자리를 따라 색소 침착을 나타냅니다. 신경 망막 섬 주변의 여러 EFP에서 잘 분화된 색소 상피 파생물이 여기에 표시됩니다. EFP의 더 높은 배율은 RPE 전구체의 이동 영역과 신경 망막 컵을 둘러싼 안구 표면 상피를 보여줍니다.
색소 세포와 비색소 세포를 모두 포함하는 미성숙 RPE 세포의 단층을 발달시킨 확장된 부착 배양이 여기에 나와 있습니다. 완전히 성숙하고 착색된 RPE 세포의 단층 배양은 60일째에 조약돌 형태를 보여줍니다. PAX6, MITF 및 RPE65를 발현하는 RPE 세포가 이 그림에 나와 있습니다.
이 이미지는 왜곡된 적층과 줄무늬가 없는 망막 전구체의 비정상적인 응집체가 있는 EFP를 나타냅니다. 미니어처 신경 망막 컵이 있지만 RPE의 주변 영역과 안구 표면 상피가 없는 EFP가 이 그림에 나와 있습니다. 대표 이미지는 현탁 배양에서 형성된 불규칙한 신경 망막 응집체를 보여줍니다.
3-4주 이내에 안구의 효율적인 유도를 달성하기 위해 IPC의 거의 합류 성장 배양을 사용하여 분화 과정을 시작하는 것이 매우 중요합니다. 정상 및 환자 특이적 IPC에서 생성된 망막 오가노이드 및 RPE 세포는 망막 질환 모델 및 새로운 치료 약물 테스트에 사용할 수 있습니다.
