פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה ויעילה להבחנה בין IPCs אנושיים לאורגנואידים נוירו-רשתית תלת-ממדיים מורכבים לצורך מחקר ויישומים רגנרטיביים. טכניקה זו מערבת תרביות דבק ותרחיף, מה שמאפשר בחירה סלקטיבית והעשרה של אורגנואידים ברשתית ותאי RP. הוא יכול להציע אספקה בת קיימא וסדירה של מקורות תאיים לפיתוח טיפולים מבוססי תאים למחלות ניווניות ברשתית.
אורגנואידים רשתית כאלה שמקורם בתאי גזע ותאי RPE שימושיים כמו מודלים במבחנה לחקר התפתחות העיניים ומחלות רשתית תורשתיות. שיטה זו ניתנת לשכפול בקלות על ידי מעבדות מחקר שכבר מכירות את הטיפול בתרביות IPSC אנושיות. הדגמה חזותית תומכת מאוד בזיהוי שדות עיניים ובבידוד גביעי רשתית עצביים בהתבסס על מיקומם המרחבי ותכונותיהם המורפולוגיות.
כדי להתחיל, לשאוף את המדיום בילה מ 70 עד 80% תרבויות IPSC אנושיות בשש בארות. הוסיפו PBS לבארות, ערבלו אותן ושאפו החוצה את חיץ הכביסה. לאחר מכן הוסיפו מיליליטר אחד של תמיסת דיסוציאציה של תאים או CDS לכל באר ודגרו על הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש עד שבע דקות עד שהתאים יתעגלו.
שאפו את ה-CDS ואספו את תרחיף התא לתוך צינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר. סובב את הצינור ב -1, 000 סל"ד במשך ארבע דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את כדורית התא ב-1.2 מיליליטר של תווך Essential 8.
יש לפזר 200 מיקרוליטר של תרחיף התא לכל באר של צלחת שש בארות מצופת מטריצה המכילה 1.5 מיליליטר של מדיום תרבית IPSC ו-10 מיקרומולר Y27632. לאחר 12 עד 24 שעות, הסירו את המדיום המשומש והוסיפו מדיום עלייה מלא שחומם מראש ללא 27632 יו' כדי לשמור על התרבויות. שנה את מדיום התרבות כל 24 שעות עד שהתרבויות מגיעות למפגש של 70 עד 80 אחוזים.
ביום האפס, שאפו החוצה את מדיום תחזוקת ה- IPSC האנושי והוסיפו מדיום אינדוקציה התמיינות המכיל ננוגרם אחד למיליליטר BFGF וננוגרם אחד למיליליטר Noggin לצלחת שש הקידוחים. דוגרים על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור של 5% פחמן דו חמצני. ביום הראשון, שאפו החוצה את המדיום המשומש והוסיפו מדיום אינדוקציה התמיינות המכיל ננוגרם אחד למיליליטר BFGF ו-10 ננוגרם למיליליטר נוגין.
דוגרים שוב על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור של 5% פחמן דו חמצני. ביום השני והשלישי, מוציאים את המדיום המשומש ומוסיפים מדיום אינדוקציה בידול המכיל 10 ננוגרם למיליליטר נוגין. לאחר הוספת שני מיליליטר למדיום באר לצלחת בת שש בארות, דוגרים על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור של 5% פחמן דו חמצני ומשנים את התווך כל 24 שעות.
ביום הרביעי, להסיר את המדיום בילה ולהוסיף את מדיום התמיינות הרשתית או RDM. בצע את אותו הליך כדי להוסיף שני מיליליטר לכל בינוני באר צלחת שש בארות לדגור את התרביות. שנה את המדיום כל יום.
בסביבות היום ה-14 וה-18, התבוננו בתרביות תחת מיקרוסקופ בהגדלה של פי 10 להופעתם של תחומים דמויי רוזטה עצבית המורכבת מאבות מוקדמים של שדה העין. בסביבות היום ה-21 וה-28, התבוננו בתרביות תחת מיקרוסקופ בהגדלה של פי 4 ו-10 כדי לצפות בהופעתם של EFPs נפרדים המאורגנים בעצמם עם אי מרכזי של מבנים נוירו-רשתית תלת-ממדיים מעגליים המוקפים בגידולים רציפים של אפיתל עצבי ואפיתל פני העין. לוקחים פיפטה סטרילית של פסטר ומחזיקים את הבסיס ביד אחת ואת קצה הנימים ביד השנייה.
מעקרים ומחממים את האזור הסמוך לאמצע קצה הנימים בתנועות סיבוביות עד שהזכוכית הופכת גמישה. לאחר מכן התרחקו מהלהבה ומשכו במהירות את קצה הנימים החוצה כדי ליצור קצה נימי דק עם לומן סגור. החזיקו את הקצה הדק אופקית מול הלהבה והעבירו אותו במהירות דרך הלהבה בתנועה החוצה כדי ליצור וו חלק או קצה נימי בצורת L.
תחת מיקרוסקופ סטריאו, בחר ידנית את גביעי הרשתית העצבית הבנויים היטב מה- EFPs הבודדים באמצעות אזור העקמומיות החיצוני החלק של וו הנימים ככף מדידה עדינה. בימים 25 ו-30, יש להוסיף ארבעה מיליליטר של מדיום התמיינות רשתית שחומם מראש בצלחת 60 מ"מ בחיבור נמוך לתרבית ולשמור על גביעי רשתית לייצור אורגנואידים תלת-ממדיים ברשתית. יש לעשות זאת לפני קצירת גביעי הרשתית העצביים.
הניחו מיקרופיפטה של מילימטר אחד כדי לשאוף 100 מיקרוליטר והשתמשו בקצוות מיקרו של מיליליטר אחד עם פתחים רחבים כדי לשאוף ולהעביר את כוסות הרשתית הצפות לצלחות התרבית הנמוכות והטריות שהוכנו קודם לכן. שמרו על גביעי הרשתית ב-RDM כתרביות תרחיף שאינן נצמדות ודגרו עליהן בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור של 5% פחמן דו חמצני. בימים 30 ו -45, בעקבות שיטת הזנה חלקית, להסיר מחצית נפח של המדיום בילה ולהחליף אותו עם נפח שווה של מדיום טרי.
ביום ה-45 וה-60, תרבית את אורגנואידי הרשתית למשך שבועיים נוספים ב-RDM המכיל 100 טאורין מיקרומולרי כדי לתמוך בהישרדות טובה יותר ובהתמיינות שושלת של אבות נוירו-רשתית ופיתוח סוגי תאי רשתית בוגרים. אורגנואידים ברשתית מאופיינים בשלבים שונים של הבשלה לביטוי של מספר סמני אב ברשתית באמצעות RT-PCR ואימונוהיסטוכימיה. תוצאות RT-PCR אישרו את ההשראות והביטוי של סמנים נוירו-רשתית באורגנואידים ברשתית בני חודש ואורגנואידים ברשתית בני חודשיים.
התמונות הקונפוקליות של מקטעים מסומנים במערכת החיסון של אורגנואידים לא בשלים ברשתית המשתמשים בנוגדנים כנגד סמני האב של הרשתית העצבית Chx10, PAX6 ו-Otx2, ואורגנואידים בוגרים ברשתית המשתמשים בנוגדנים כנגד הסמנים המקדימים של קולטני האור מחלימים ו-CRX מוצגות כאן. השכבה החיצונית המסומנת ביותר של אורגנואידי הרשתית עם תאים קולטי אור מתמיינים מוגדלים ומוצגים בתמונות אלה. השלוחות הפנימיות הבסיסיות דמויות המקטע מסומנות בחצים לבנים.
אשכולות EFP עם גביע הרשתית העצבית במרכז וגידולי RPE נודדים מראים פיגמנטציה לאורך הקצוות המובילים. גידולי אפיתל פיגמנטיים מובחנים היטב ממספר EFPs בכל רחבי האי נוירו רשתית מוצגים כאן. הגדלה גבוהה יותר של EFP מראה את אזור הנדידה של אבות RPE ואפיתל פני השטח של העין סביב גביע רשתית נוירו.
תרביות דבק מורחבות שפיתחו מונושכבות של תאי RPE לא בשלים המכילים תאים פיגמנטיים ותאים שאינם פיגמנטים מוצגות כאן. תרביות חד-שכבתיות של תאי RPE בוגרים לחלוטין ופיגמנטים מראות מורפולוגיה מרוצפת ביום ה-60. תאי RPE המבטאים PAX6, MITF ו-RPE65 מוצגים באיור זה.
תמונות אלה מייצגות EFPs עם צברים חריגים של אבות רשתית עם למינציה מעוותת וחוסר פסיעות. EFP עם גביע נוירו רשתית מיניאטורי, אך חסר את האזור שמסביב של RPE ואפיתל משטח העין מוצגים באיור זה. התמונה המייצגת מראה אגרגטים נוירו-רשתית לא סדירים שנוצרו בתרבית התרחיף.
זה מאוד קריטי להתחיל את תהליך ההתמיינות באמצעות תרביות גידול כמעט משולבות של IPCs כדי להשיג אינדוקציה יעילה של שדות עיניים בתוך שלושה עד ארבעה שבועות. אורגנואידים ברשתית ותאי RPE הנוצרים מ- IPC נורמלי וספציפי למטופל יכולים לשמש כמודלים למחלות רשתית ולבדיקת תרופות טיפוליות חדשניות.
