يصف هذا البروتوكول طريقة بسيطة وفعالة للتمييز بين الخلايا الجذعية البشرية إلى عضويات شبكية عصبية ثلاثية الأبعاد معقدة للبحث والتطبيقات التجديدية. تتضمن هذه التقنية كلا من الثقافات الملتصقة والمعلقة ، مما يسمح بالانتقاء والإثراء الانتقائي لكل من عضويات الشبكية وخلايا RP. يمكن أن يوفر إمدادات قابلة للحياة ومنتظمة من مصادر الخلايا لتطوير العلاجات القائمة على الخلايا للأمراض التنكسية في شبكية العين.
هذه العضوية الشبكية المشتقة من الخلايا الجذعية وخلايا RPE مفيدة كما في النماذج المختبرية لدراسة نمو العين وأمراض الشبكية الموروثة. يمكن تكرار هذه الطريقة بسهولة من قبل مختبرات الأبحاث التي هي بالفعل على دراية بالتعامل مع ثقافات IPSC البشرية. يدعم العرض البصري بشكل كبير تحديد حقول العين وعزل أكواب الشبكية العصبية بناء على موقعها المكاني وخصائصها المورفولوجية.
للبدء ، استنشاق الوسط المستهلك من 70 إلى 80٪ من ثقافات IPSC البشرية المتقاربة في ألواح من ستة آبار. أضف برنامج تلفزيوني إلى الآبار ، وقم بتدويرها واستنشاق المخزن المؤقت للغسيل. ثم أضف ملليلترا واحدا من محلول تفكك الخلايا أو CDS إلى كل بئر واحتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة خمس إلى سبع دقائق حتى تتقارب الخلايا.
نضح CDS وجمع تعليق الخلية في أنبوب طرد مركزي 15 ملليلتر. أدر الأنبوب عند 1،000 دورة في الدقيقة لمدة أربع دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 1.2 ملليلتر من الوسط الأساسي 8.
قم بتوزيع 200 ميكرولتر من معلق الخلية في كل بئر من صفيحة ستة آبار مغلفة بالمصفوفة تحتوي على 1.5 ملليلتر من وسط زراعة IPSC و 10 ميكرومولار Y27632. بعد 12 إلى 24 ساعة ، قم بإزالة الوسط المستهلك وإضافة وسط صعود كامل تم تسخينه مسبقا بدون Y27632 للحفاظ على الثقافات. قم بتغيير وسط الثقافة كل 24 ساعة حتى تصل الثقافات إلى التقاء 70 إلى 80٪.
في اليوم صفر ، قم باستنشاق وسيط صيانة IPSC البشري وإضافة وسيط تحريض التمايز الذي يحتوي على نانوجرام واحد لكل مليلتر BFGF ونانوجرام واحد لكل مليلتر Noggin إلى لوحة الآبار الستة. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون 5٪. في اليوم الأول ، قم باستنشاق الوسط المستهلك وإضافة وسط تحريض التمايز الذي يحتوي على نانوجرام واحد لكل مليلتر BFGF و 10 نانوجرام لكل مليلتر Noggin.
احتضان الخلايا مرة أخرى عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون 5٪. في اليوم الثاني والثالث ، قم بإزالة الوسط المستهلك وإضافة وسط تحريض التمايز الذي يحتوي على 10 نانوجرام لكل مليلتر Noggin. بعد إضافة ملليلتر لكل بئر متوسط إلى صفيحة من ستة آبار ، احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ وقم بتغيير الوسط كل 24 ساعة.
في اليوم الرابع ، قم بإزالة الوسط المستهلك وإضافة وسيط تمايز الشبكية أو RDM. اتبع نفس الإجراء لإضافة ملليلتر لكل بئر متوسط إلى صفيحة من ستة آبار ولاحتضان الثقافات. تغيير الوسيط كل يوم.
في حوالي اليوم 14 و 18 ، راقب الثقافات تحت المجهر عند تكبير 10X لظهور مجالات شبيهة بالوردة العصبية تتكون من أسلاف حقل العين المبكر. في حوالي اليوم 21 و 28 ، راقب الثقافات تحت المجهر عند تكبير 4X و 10X لمراقبة ظهور EFPs متميزة ذاتية التنظيم مع جزيرة مركزية من هياكل شبكية العين العصبية الدائرية 3D محاطة بنواتج متجاورة من ظهارة عصبية وظهارة سطح العين. خذ ماصة باستور معقمة وأمسك القاعدة بيد واحدة والطرف الشعري في اليد الأخرى.
تعقيم اللهب وتسخين المنطقة بالقرب من منتصف الطرف الشعري بحركات دورانية حتى يصبح الزجاج مرنا. ثم ابتعد عن اللهب واسحب الطرف الشعري بسرعة للخارج لإنشاء طرف شعري ناعم بتجويف مغلق. أمسك الطرف الرفيع أفقيا أمام اللهب وقم بتمريره بسرعة عبر اللهب بحركة خارجية لإنشاء خطاف أملس أو طرف شعري على شكل حرف L.
تحت مجهر ستيريو ، اختر يدويا أكواب الشبكية العصبية جيدة التكوين من العبوات الناسفة الخارقة الفردية باستخدام منطقة الانحناء الخارجي الأملس للخطاف الشعري كمغرفة دقيقة. في اليومين 25 و 30 ، أضف أربعة ملليلتر من وسط تمايز الشبكية المسخن مسبقا في طبق منخفض المرفق 60 ملم للثقافة والحفاظ على أكواب الشبكية لتوليد عضويات شبكية ثلاثية الأبعاد. يجب أن يتم ذلك قبل حصاد أكواب الشبكية العصبية.
اضبط ماصة صغيرة بحجم ملليمتر واحد لشفط 100 ميكرولتر واستخدم أطراف ميكرو ملليلتر واحدة مع فتحات تجويف واسعة لشفط ونقل أكواب الشبكية العائمة إلى أطباق الثقافة الطازجة منخفضة الالتصاق المعدة مسبقا. الحفاظ على أكواب الشبكية في RDM كمزارع تعليق غير ملتصقة واحتضانها عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪. في اليومين 30 و 45 ، باتباع طريقة التغذية الجزئية ، قم بإزالة نصف حجم الوسط المستهلك واستبدله بحجم متساو من الوسط الطازج.
في اليوم 45 و 60 ، قم بزراعة عضويات الشبكية لمدة أسبوعين آخرين في RDM تحتوي على 100 ميكرومولار توراين لدعم بقاء أفضل وتمايز نسب أسلاف الشبكية العصبية وتطوير أنواع خلايا الشبكية الناضجة. تتميز عضويات الشبكية في مراحل مختلفة من النضج للتعبير عن العديد من علامات السلف الشبكية باستخدام RT-PCR والكيمياء الهيستولوجية المناعية. أكدت نتائج RT-PCR تحريض وتعبير علامات الشبكية العصبية في عضويات الشبكية البالغة من العمر شهرا واحدا وعضويات الشبكية البالغة من العمر شهرين.
الصور متحدة البؤر للأقسام ذات العلامات المناعية لعضويات الشبكية غير الناضجة التي تستخدم الأجسام المضادة ضد علامات السلف العصبي الشبكي Chx10 و PAX6 و Otx2 ، وعضويات الشبكية الناضجة باستخدام الأجسام المضادة ضد علامات السلائف المستقبلة للضوء recoverin و CRX موضحة هنا. يتم تكبير الطبقة الخارجية المميزة من عضويات الشبكية مع خلايا مستقبلات الضوء المتمايزة وتظهر في هذه الصور. يتم تمييز الامتدادات البدائية التي تشبه الجزء الداخلي بأسهم بيضاء.
تظهر مجموعات EFP مع كوب الشبكية العصبية في المركز ونمو RPE المهاجر تصبغا على طول الحواف الأمامية. تظهر هنا النتوءات الطلائية المصطبغة جيدة التمايز من العديد من العبوات الناسفة الخارقة في جميع أنحاء الجزيرة العصبية الشبكية. يظهر التكبير العالي للعبوة الناسفة الخارقة منطقة هجرة أسلاف RPE وظهارة سطح العين المحيطة بكأس الشبكية العصبية.
يتم عرض الثقافات الملتصقة الممتدة التي طورت طبقة أحادية من خلايا RPE غير الناضجة التي تحتوي على كل من الخلايا المصطبغة وغير المصطبغة هنا. تظهر الثقافات أحادية الطبقة لخلايا RPE الناضجة تماما والمصطبغة مورفولوجيا الحصاة في اليوم 60. يظهر هذا الشكل خلايا RPE التي تعبر عن PAX6 و MITF و RPE65.
تمثل هذه الصور EFPs مع مجاميع غير طبيعية من أسلاف الشبكية مع التصفيح المشوه ونقص التشققات. يظهر في هذا الشكل EFP مع كأس الشبكية العصبي المصغر ، ولكنه يفتقر إلى المنطقة المحيطة من RPE وظهارة سطح العين. تظهر الصورة التمثيلية مجاميع شبكية عصبية غير منتظمة تشكلت في ثقافة التعليق.
ومن الأهمية بمكان بدء عملية التمايز باستخدام مزارع النمو شبه المتقاربة للخلايا المتكاملة للبراءات لتحقيق تحريض فعال لحقول العين في غضون ثلاثة إلى أربعة أسابيع. يمكن استخدام عضويات الشبكية وخلايا RPE المتولدة من الخلايا الجذعية الوعائية العادية والخاصة بالمريض كنماذج لأمراض الشبكية ولاختبار الأدوية العلاجية الجديدة.
