Dieses Protokoll beschreibt eine einfache und effiziente Methode zur Differenzierung humaner IPCs in komplexe dreidimensionale neuroretinale Organoide für Forschung und regenerative Anwendungen. Diese Technik umfasst sowohl Adhärent- als auch Suspensionskulturen, was eine selektive Entnahme und Anreicherung sowohl von retinalen Organoiden als auch von RP-Zellen ermöglicht. Es kann eine praktikable und regelmäßige Versorgung mit Zellquellen für die Entwicklung zellbasierter Therapien für degenerative Netzhauterkrankungen bieten.
Solche aus Stammzellen gewonnenen Netzhautorganoide und RPE-Zellen sind als In-vitro-Modelle nützlich, um die Augenentwicklung und erbliche Netzhauterkrankungen zu untersuchen. Diese Methode kann leicht von Forschungslaboren repliziert werden, die bereits mit dem Umgang mit humanen IPSC-Kulturen vertraut sind. Die visuelle Demonstration unterstützt die Identifizierung von Augenfeldern und die Isolierung von Neuro-Retinaschalen auf der Grundlage ihrer räumlichen Positionierung und morphologischen Merkmale.
Zunächst wird das verbrauchte Medium von 70 bis 80 % konfluenten humanen IPSC-Kulturen in Sechs-Well-Platten abgesaugt. Geben Sie PBS in die Vertiefungen, schwenken Sie sie und saugen Sie den Waschpuffer ab. Geben Sie dann einen Milliliter Zelldissoziationslösung oder CDS in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius fünf bis sieben Minuten lang, bis sich die Zellen aufrunden.
Saugen Sie das CDS ab und sammeln Sie die Zellsuspension in einem 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Drehen Sie das Röhrchen vier Minuten lang bei Raumtemperatur bei 1.000 U/min. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 1,2 Millilitern Essential 8 Medium.
Geben Sie 200 Mikroliter der Zellsuspension in jede Vertiefung einer matrixbeschichteten Sechs-Well-Platte, die 1,5 Milliliter IPSC-Nährmedium und 10 mikromolare Y27632 enthält. Entfernen Sie nach 12 bis 24 Stunden das verbrauchte Medium und fügen Sie vorgewärmtes vollständiges Aszensionsmedium ohne Y27632 hinzu, um die Kulturen zu erhalten. Wechseln Sie das Nährmedium alle 24 Stunden, bis die Kulturen eine Konfluenz von 70 bis 80 % erreicht haben.
Am Tag Null saugen Sie das humane IPSC-Erhaltungsmedium ab und geben Sie Differenzierungsinduktionsmedium mit einem Nanogramm pro Milliliter BFGF und einem Nanogramm pro Milliliter Noggin in die Sechs-Well-Platte. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in einem 5%Kohlendioxid-Inkubator. Am ersten Tag saugen Sie das verbrauchte Medium ab und fügen Sie Differenzierungsinduktionsmedium hinzu, das ein Nanogramm pro Milliliter BFGF und 10 Nanogramm pro Milliliter Noggin enthält.
Inkubieren Sie die Zellen erneut bei 37 Grad Celsius in einem 5%Kohlendioxid-Inkubator. Entfernen Sie am zweiten und dritten Tag das verbrauchte Medium und fügen Sie Differenzierungsinduktionsmedium mit 10 Nanogramm pro Milliliter Noggin hinzu. Nach der Zugabe von zwei Millilitern pro Well-Medium zu einer Sechs-Well-Platte werden die Zellen bei 37 Grad Celsius in einem 5%-Kohlendioxid-Inkubator inkubiert und das Medium alle 24 Stunden gewechselt.
Entfernen Sie am vierten Tag das verbrauchte Medium und fügen Sie das retinale Differenzierungsmedium oder RDM hinzu. Befolgen Sie das gleiche Verfahren, um zwei Milliliter pro Well-Medium zu einer Sechs-Well-Platte hinzuzufügen und die Kulturen zu inkubieren. Wechseln Sie das Medium jeden Tag.
Etwa an Tag 14 und 18 werden die Kulturen unter dem Mikroskop bei 10-facher Vergrößerung auf das Entstehen von neuronalen rosettenartigen Domänen beobachtet, die aus frühen Vorläuferzellen des Augenfeldes bestehen. Beobachten Sie die Kulturen etwa an Tag 21 und 28 unter dem Mikroskop bei 4- und 10-facher Vergrößerung, um das Entstehen von selbstorganisierten, unterschiedlichen EFPs mit einer zentralen Insel aus kreisförmigen 3D-Neuroretinalstrukturen zu beobachten, die von zusammenhängenden Auswüchsen des Neuroepithels und des Augenoberflächenepithels umgeben sind. Nehmen Sie eine sterile Pasteurpipette und halten Sie die Basis in der einen Hand und die Kapillarspitze in der anderen.
Flammsterilisieren und erhitzen Sie den Bereich nahe der Mitte der Kapillarspitze mit Rotationsbewegungen, bis das Glas biegsam wird. Entfernen Sie sich dann von der Flamme und ziehen Sie die Kapillarspitze zügig nach außen, um eine feine Kapillarspitze mit geschlossenem Lumen zu erzeugen. Halten Sie die feine Spitze waagerecht vor die Flamme und führen Sie sie schnell in einer nach außen gerichteten Bewegung durch die Flamme, um einen glatten Haken oder eine L-förmige Kapillarspitze zu erzeugen.
Unter einem Stereomikroskop werden die wohlgeformten Neuroretinalschalen manuell von den einzelnen EFPs entnommen, wobei die glatte äußere Krümmungszone des Kapillarhakens als feine Schaufel verwendet wird. An den Tagen 25 und 30 werden vier Milliliter vorgewärmtes Netzhautdifferenzierungsmedium in einer 60-Millimeter-Schale mit niedrigem Ansatz in die Kultur gegeben und Netzhautschalen zur Erzeugung von 3D-Netzhautorganoiden aufbewahrt. Dies sollte vor der Entnahme der Neuro-Retinal-Cups erfolgen.
Stellen Sie eine Ein-Millimeter-Mikropipette ein, um 100 Mikroliter anzusaugen, und verwenden Sie einen Milliliter Mikrospitzen mit breiten Bohrungsöffnungen, um die schwimmenden Netzhautbecher anzusaugen und in die frischen, zuvor zubereiteten Kulturschalen mit geringer Haftung zu übertragen. Bewahren Sie die Netzhautschalen in RDM als nicht-adhärente Suspensionskulturen auf und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius in einem 5%Kohlendioxid-Inkubator. Entfernen Sie an den Tagen 30 und 45 nach einer Teilfütterung die Hälfte des Volumens des verbrauchten Mediums und ersetzen Sie es durch ein gleiches Volumen frisches Medium.
An Tag 45 und 60 werden die retinalen Organoide für weitere zwei Wochen in RDM kultiviert, das 100 mikromolare Taurin enthält, um ein besseres Überleben und eine bessere Abstammungsdifferenzierung der neuroretinalen Vorläuferzellen und die Entwicklung reifer Netzhautzelltypen zu unterstützen. Retinale Organoide werden in verschiedenen Reifungsstadien für die Expression verschiedener retinaler Vorläufermarker mittels RT-PCR und Immunhistochemie charakterisiert. Die Ergebnisse der RT-PCR bestätigten die Induktion und Expression von neuroretinalen Markern in ein Monat alten Netzhautorganoiden und zwei Monate alten Netzhautorganoiden.
Die konfokalen Bilder von immunmarkierten Schnitten von unreifen Netzhautorganoiden mit Antikörpern gegen die neuroretinalen Vorläufermarker Chx10, PAX6 und Otx2 und reifen Netzhautorganoiden mit Antikörpern gegen die Photorezeptor-Vorläufermarker Recoverin und CRX sind hier dargestellt. Die markierte äußerste Schicht der Netzhautorganoide mit differenzierenden Photorezeptorzellen ist gezoomt und in diesen Bildern dargestellt. Die rudimentären inneren segmentartigen Fortsätze sind durch weiße Pfeile markiert.
EFP-Cluster mit der Neuro-Retina-Schale in der Mitte und migrierenden RPE-Auswüchsen zeigen eine Pigmentierung entlang der Vorderkanten. Gut differenzierte pigmentierte Epithelauswüchse von mehreren EFPs rund um die neuroretinale Insel sind hier dargestellt. Eine höhere Vergrößerung eines EFP zeigt die Wanderzone der RPE-Vorläuferzellen und das Epithel der Augenoberfläche, das eine neuroretinale Schale umgibt.
Ausgedehnte adhärente Kulturen, die Monoschichten von unreifen RPE-Zellen entwickelt haben, die sowohl pigmentierte als auch nicht-pigmentierte Zellen enthalten, sind hier zu sehen. Monolayer-Kulturen von voll ausgereiften und pigmentierten RPE-Zellen zeigen eine Kopfsteinpflaster-Morphologie am 60. Tag. In dieser Abbildung sind RPE-Zellen dargestellt, die PAX6, MITF und RPE65 exprimieren.
Diese Bilder stellen EFPs mit abnormen Aggregaten von retinalen Vorläuferzellen mit verzerrter Laminierung und fehlenden Streifen dar. EFP mit der Miniatur-Neuro-Retina-Schale, aber ohne die umgebende Zone von RPE und Augenoberflächenepithel sind in dieser Abbildung dargestellt. Das repräsentative Bild zeigt unregelmäßige neuroretinale Aggregate, die sich in der Suspensionskultur gebildet haben.
Es ist sehr wichtig, den Differenzierungsprozess mit Hilfe von nahezu konfluent wachsenden Kulturen von IPCs zu beginnen, um eine effiziente Induktion von Augenfeldern innerhalb von drei bis vier Wochen zu erreichen. Retinale Organoide und RPE-Zellen, die aus normalen und patientenspezifischen IPCs generiert werden, können als Modelle für Netzhauterkrankungen und für die Erprobung neuer therapeutischer Medikamente verwendet werden.
