一种在蜱细胞系中用荧光蛋白表达穿梭载体转化立 克次 体属的电穿孔方法

立克次体基因的功能研究对于理解它们在发病机制中的作用至关重要，因此我们需要可靠的方法来以受控方式改变基因。我们的协议使用电穿孔将外源性DNA引入立克次体属的专性细胞内细菌中，从而使我们能够研究引入的DNA的影响。今天和我一起演示该程序的是Lisa Price，来自Munderloh博士和Kurtti博士实验室的研究员。

首先，如文中所述制备90%至100%帕氏立克次氏体感染的ISE6细胞培养物。然后，为了通过吉姆萨染色确定感染率，将细胞悬液与完全培养基稀释至1:5的比例，并通过以113G离心将100微升细胞悬液沉积到玻璃显微镜载玻片上五分钟。让载玻片风干后，在室温下将其固定在无水甲醇中五分钟。

然后，将载玻片和吉姆萨染色在 30 摄氏度下孵育 37 分钟。接下来，用水冲洗载玻片，干燥后，在带有油物镜的光学显微镜下观察。通过计数感染和未感染细胞来确定感染细胞的百分比。

为了制备无细胞立克次氏体，将约0.2毫升无菌60至90碳化硅砂砾倒入两个两毫升无菌微量离心管中，并将管放在一边。从先前接种的含有五毫升培养基的帕克次氏立克次氏体感染烧瓶中，除去两毫升培养基，注意不要干扰细胞层。然后，用剩余的三毫升培养基重悬细胞。

将该悬浮液平均分配给两个准备好的碳化硅砂砾管，并高速涡旋管30秒。然后，将它们放在冰上。接下来，通过伸出柱塞来准备无菌的 5 毫升鲁尔锁注射器，并将柱塞端插入用于固定 15 毫升锥形管的聚苯乙烯基座中。

使用带有橡胶球操作的屏障两毫升巴斯德移液器，小心地去除涡旋细胞的上清液，不要吸入任何砂砾。然后，将移液器吸头插入注射器集线器开口，并以轻压将内容物弹出注射器中。接下来，通过安装在注射器集线器上的无菌两微米孔径过滤器将帕氏立克次氏体培养物过滤到无菌的 1.5 毫升管中，并在 13， 600 G 下以 4 摄氏度离心管五分钟。

除去上清液后，用1.2毫升300毫摩尔冰冷蔗糖溶液洗涤细胞沉淀两次。离心样品并在两次洗涤之间除去上清液。在离心结束时，分别用100至150微升冰冷的蔗糖溶液重悬混合的细胞沉淀，用于两到三个转化样品。

然后，将样品在预冷、无菌、1.5 微升微量离心管中分成 50 微升等分试样。为了将3微克无内毒素pRAM18sSFA质粒DNA转化为含有50微升帕氏立克次氏体的每管冰上，并用移液器吸头轻轻搅拌。将混合物转移到间隙尺寸为0.1厘米的预冷无菌电穿孔比色皿中。

轻轻敲击比色皿以均匀分布混合物，并在冰上孵育 10 到 30 分钟。同时，从完全融合的先前培养的ISE6细胞培养瓶中取出培养基，并通过用1.5毫升含有碳酸氢钠和HEPES缓冲液的新鲜培养基轻轻冲洗细胞来重悬细胞层。产生均匀的细胞悬液后，将整个体积转移到单个无菌的两毫升微量离心管中。

接下来，使用电穿孔器电穿孔帕氏立克次氏体和质粒DNA混合物。电穿孔后，使用无菌扩展细尖移液器将少量ISE6细胞悬液转移到比色皿中，然后轻轻上下移液以回收电穿孔的帕氏立克次体。然后，将比色皿的内容物转移到含有ISE6细胞悬液剩余部分的两毫升管中。

接下来，在室温下离心样品，首先以700 G离心两分钟以拉下ISE6细胞，然后在13， 600 G下离心一分钟以拉下立克次体。将试管在 34 摄氏度下孵育 15 分钟至 1 小时。孵育后，将一种转化的重悬内容物转移到一个25平方厘米的细胞培养瓶中，该培养瓶含有3.5毫升含有碳酸氢钠和HEPES缓冲液的新鲜培养基。

摇动烧瓶以使混合物均匀分布并在 34 摄氏度下孵育。16至24小时后，将大观霉素和链霉素各10微升加入孵育烧瓶中。摇动烧瓶，将抗生素均匀地混合到培养基中，然后将烧瓶放回培养箱中。

野生型帕氏立克次体和ISE6细胞的成功增殖通过吉姆萨染色可见。ISE6细胞的细胞核在细胞内和细胞外立克次氏体中被吉姆萨染色为深紫色是可见的。孵育7天后，通过共聚焦显微镜证实了在ISE6细胞中表达红色荧光蛋白的帕氏立克次氏体的转化。

10天后观察到感染率大幅增加。在整个过程中保持所有无菌。注意细节并保持耐心，因为某些种类的立克次氏体需要很长时间才能转化，尤其是生长缓慢的内共生体。

该协议使立克次体生物学的多个方面及其与节肢动物载体和哺乳动物宿主的相互作用得以研究。例如，表达荧光蛋白的立克次氏体已被用于跟踪运动性和共生体蜱细胞相互作用。