Rickettsia genlerinin fonksiyonel çalışmaları, patogenezdeki rollerini anlamak için çok önemlidir, bu nedenle genleri kontrollü bir şekilde değiştirmek için güvenilir yöntemlere ihtiyacımız vardır. Protokolümüz, eksojen DNA'yı Rickettsia cinsinin zorunlu hücre içi bakterilerine sokmak için elektroporasyon kullanır, böylece tanıtılan DNA'nın etkilerini incelememize izin verir. Bugün benimle birlikte prosedürü gösterecek olan Lisa Price, Dr. Munderloh ve Dr. Kurtti'nin laboratuvarından bir araştırmacı olacak.
Başlamak için, metinde açıklandığı gibi% 90 ila% 100 Rickettsia parkeri ile enfekte olmuş ISE6 hücre kültürü hazırlayın. Daha sonra, Giemsa boyama ile enfeksiyon oranını belirlemek için, hücre süspansiyonunu tam ortam ile 1: 5 oranında seyreltin ve hücre süspansiyonunun 100 mikrolitresini beş dakika boyunca 113 G'de santrifüjleme yoluyla bir cam mikroskop sürgüsüne yatırın. Slaytın havayı kurumasına izin verdikten sonra, oda sıcaklığında beş dakika boyunca mutlak bir metanol sabitleyin.
Ardından, slaytı ve Giemsa lekesini 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra, kaydırağı suda durulayın ve kuruduktan sonra, yağ hedefleri olan hafif bir mikroskop altında görüntüleyin. Enfekte olmuş ve enfekte olmayan hücreleri sayarak enfekte olmuş hücrelerin yüzdesini belirleyin.
Hücresiz Rickettsia parkeri'yi hazırlamak için, iki mililitrelik steril mikrosantrifüj tüplerine yaklaşık 0,2 mililitre steril 60 ila 90 silikon karbür kum dökün ve tüpleri bir kenara koyun. Beş mililitre ortam içeren daha önce aşılanmış bir Rickettsia parkeri ile enfekte olmuş şişeden, hücre tabakasını rahatsız etmemeye dikkat ederek ortamın iki mililitresini çıkarın. Ardından, hücreleri ortamın kalan üç mililitresi ile yeniden askıya alın.
Bu süspansiyonu hazırlanan iki silikon karbür kum tüpü arasında eşit olarak bölün ve tüpü 30 saniye boyunca yüksek hızda vorteksleyin. Ardından, onları buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra, pistonu uzatarak steril bir beş mililitrelik luer kilit şırıngası hazırlayın ve piston ucunu 15 mililitrelik konik tüpleri tutmak için kullanılan bir polistiren tabana yerleştirin.
Kauçuk bir ampulle çalıştırılan iki mililitrelik bir bariyer Pasteur pipeti kullanarak, vorteks hücrelerinin süpernatantını herhangi bir kum emmeden dikkatlice çıkarın. Ardından, pipet ucunu şırınga göbeği açıklığına yerleştirin ve içeriği hafif bir basınçla şırıngaya çıkarın. Daha sonra, Rickettsia parkeri kültürünü, şırınga göbeğine takılı steril iki mikrometrelik gözenek boyutundaki bir filtreden steril 1,5 mililitrelik tüplere filtreleyin ve tüpleri dört santigrat derecede beş dakika boyunca 13.600 G'de santrifüj edin.
Süpernatanı çıkardıktan sonra, hücre peletini iki kez 1.2 mililitre 300 milimolar buz gibi soğuk sakkaroz çözeltisi ile yıkayın. Numuneyi santrifüj edin ve yıkamalar arasında süpernatantı çıkarın. Santrifüjlemenin sonunda, havuzlanmış hücre peletini sırasıyla iki ila üç transformasyon numunesi için 100 ila 150 mikrolitre buz gibi soğuk sakkaroz çözeltisi ile yeniden askıya alın.
Daha sonra, numuneyi önceden soğutulmuş, steril, 1.5 mikrolitrelik mikrosantrifüj tüplerinde 50 mikrolitrelik alikotlara bölün. Üç mikrogram endotoksin içermeyen pRAM18sSFA plazmid DNA'sında, buz üzerinde 50 mikrolitre Rickettsia parkeri içeren her tüpe transformasyon için ve bir pipet ucu ile hafifçe karıştırın. Karışımı 0,1 santimetre boşluk boyutuna sahip önceden soğutulmuş steril bir elektroporasyon küvetine aktarın.
Karışımı eşit şekilde dağıtmak için küvete hafifçe dokunun ve 10 ila 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Bu arada, ortamı daha önce kültürlenmiş tam olarak akışkanlaştırılmış bir ISE6 hücre kültürü şişesinden çıkarın ve hücreleri sodyum bikarbonat ve HEPES tamponu içeren 1.5 mililitre taze ortam ile nazikçe durulayarak hücre tabakasını yeniden askıya alın. Homojen bir hücre süspansiyonu oluşturduktan sonra, tüm hacmi tek bir steril iki mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
Daha sonra, bir elektroporatör kullanarak Rickettsia parkeri ve plazmid DNA karışımını elektroporatlayın. Elektroporasyondan sonra, az miktarda ISE6 hücre süspansiyonunu küvete aktarmak için steril genişletilmiş ince uçlu bir pipet kullanın ve elektroporated Rickettsia parkeri'yi geri kazanmak için hafifçe yukarı ve aşağı pipet kullanın. Ardından, küvetin içeriğini ISE6 hücre süspansiyonunun geri kalanını içeren iki mililitrelik tüpe aktarın.
Daha sonra, numuneyi oda sıcaklığında, önce ISE6 hücrelerini aşağı çekmek için iki dakika boyunca 700 G'de, ardından Rickettsia'yı aşağı çekmek için bir dakika boyunca 13.600 G'de santrifüj yapın. Tüpü 15 dakika ila bir saat boyunca 34 santigrat derecede inkübe edin. Kuluçkadan sonra, bir dönüşümün yeniden askıya alınmış içeriğini, sodyum bikarbonat ve HEPES tamponu ile 3,5 mililitre taze ortam içeren 25 santimetrekarelik bir hücre kültürü şişesine aktarın.
Karışımı eşit şekilde yaymak ve 34 santigrat derecede kuluçkaya yatırmak için şişeyi sallayın. 16 ila 24 saat sonra, inkübe edilmiş şişeye spektinomisin ve streptomisin her biri 10 mikrolitre ekleyin. Şişeyi inkübatöre geri döndürmeden önce antibiyotikleri ortama eşit şekilde karıştırmak için şişeyi sallayın.
Vahşi tip Rickettsia parkeri ve ISE6 hücrelerinin başarılı bir şekilde yayılması, Giemsa boyaması ile belirgindi. ISE6 hücrelerinin çekirdekleri, hücre içi Giemsa ve hücre dışı Rickettsi ile koyu mor renkte boyanmıştır. ISE6 hücrelerinde kırmızı floresan proteinini eksprese eden Rickettsia parkeri'nin transformasyonu, yedi günlük inkübasyondan sonra konfokal mikroskopi ile doğrulandı.
10 gün sonra enfeksiyon oranında önemli bir artış gözlendi. Tüm prosedür boyunca her şeyi steril tutun. Detaylara dikkat edin ve sabırlı olun, çünkü bazı Rickettsia türlerinin dönüşmesi, özellikle de yavaş büyüyen endosimbiyontların dönüşmesi uzun zaman alır.
Bu protokol, Rickettsia biyolojisinin birçok yönünün ve eklembacaklı vektörleri ve memeli konakçıları ile etkileşimlerinin incelenmesini sağlamıştır. Örneğin, floresan proteini eksprese eden Rickettsi, hareketliliği ve simbiyont kene hücresi etkileşimlerini izlemek için kullanılmıştır.
