Les études fonctionnelles des gènes de Rickettsia sont cruciales pour comprendre leur rôle dans la pathogenèse, nous avons donc besoin de méthodes fiables pour modifier les gènes de manière contrôlée. Notre protocole utilise l’électroporation pour introduire de l’ADN exogène dans les bactéries intracellulaires obligatoires du genre Rickettsia, nous permettant ainsi d’étudier les effets de l’ADN introduit. Lisa Price, chercheuse du laboratoire du Dr Munderloh et du Dr Kurtti, fera la démonstration de la procédure avec moi aujourd’hui.
Pour commencer, préparez une culture cellulaire ISE6 infectée à 90 à 100% par Rickettsia parkeri comme décrit dans le texte. Ensuite, pour déterminer le taux d’infection par coloration de Giemsa, diluer la suspension cellulaire dans un rapport de 1:5 avec un milieu complet et déposer 100 microlitres de la suspension cellulaire sur une lame de microscope en verre par centrifugation à 113 G pendant cinq minutes. Après avoir laissé sécher la glissière à l’air, fixez-la dans un méthanol absolu pendant cinq minutes à température ambiante.
Ensuite, incuber la lame et la coloration Giemsa pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, rincez la lame à l’eau et une fois sèche, visualisez-la au microscope optique avec des objectifs d’huile. Déterminez le pourcentage de cellules infectées en comptant les cellules infectées et non infectées.
Pour préparer le Rickettsia parkeri sans cellules, versez environ 0,2 millilitre de gravier stérile de carbure de silicium de 60 à 90 dans deux tubes microcentrifugés stériles de deux millilitres et mettez les tubes de côté. D’une fiole infectée par Rickettsia parkeri préalablement inoculée contenant cinq millilitres de milieu, retirer deux millilitres du milieu en prenant soin de ne pas perturber la couche cellulaire. Ensuite, remettez les cellules en suspension avec les trois millilitres restants du milieu.
Répartir cette suspension également entre les deux tubes de grain en carbure de silicone préparés et vorter le tube à grande vitesse pendant 30 secondes. Ensuite, placez-les sur de la glace. Ensuite, préparez une seringue stérile Luer Lock de cinq millilitres en étendant le piston et insérez l’extrémité du piston dans une base en polystyrène utilisée pour contenir des tubes coniques de 15 millilitres.
À l’aide d’une pipette Pasteur barrière de deux millilitres actionnée avec une ampoule en caoutchouc, retirez soigneusement le surnageant des cellules vortex sans aspirer de gravier. Ensuite, insérez l’embout de la pipette dans l’ouverture du moyeu de la seringue et éjectez le contenu dans la seringue avec une légère pression. Ensuite, filtrez la culture de Rickettsia parkeri dans des tubes stériles de 1,5 millilitre à travers un filtre stérile de deux micromètres monté sur le moyeu de la seringue et centrifugez les tubes à 13 600 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.
Après avoir retiré le surnageant, lavez la pastille de cellule deux fois avec 1,2 millilitre de solution de saccharose glacée de 300 millimolaires. Centrifuger l’échantillon et retirer le surnageant entre les lavages. À la fin de la centrifugation, remettre en suspension la pastille cellulaire regroupée avec 100 à 150 microlitres de solution de saccharose glacée pour deux à trois échantillons de transformation, respectivement.
Ensuite, divisez l’échantillon en aliquotes de 50 microlitres dans des tubes microcentrifugés pré-refroidis et stériles de 1,5 microlitre. Pour la transformation à trois microgrammes d’ADN plasmidique pRAM18sSFA exempt d’endotoxines dans chaque tube contenant 50 microlitres de Rickettsia parkeri sur glace et remuer doucement avec un embout de pipette. Transférer le mélange dans une cuvette d’électroporation stérile pré-refroidie avec une taille d’écart de 0,1 centimètre.
Tapotez délicatement la cuvette pour répartir uniformément le mélange et incuber sur de la glace pendant 10 à 30 minutes. Pendant ce temps, retirer le milieu d’un flacon de culture cellulaire ISE6 préalablement cultivé entièrement confluent et remettre en suspension la couche cellulaire en rinçant doucement les cellules avec 1,5 millilitre de milieu frais contenant du bicarbonate de sodium et un tampon HEPES. Après avoir généré une suspension cellulaire homogène, transférer tout le volume dans un seul tube microcentrifuge stérile de deux millilitres.
Ensuite, électroporate le mélange d’ADN Rickettsia parkeri et plasmidique à l’aide d’un électroporateur. Après électroporation, utilisez une pipette stérile à pointe fine étendue pour transférer une petite quantité de la suspension cellulaire ISE6 dans la cuvette et pipette doucement de haut en bas pour récupérer le Rickettsia parkeri électroporé. Ensuite, transférez le contenu de la cuvette dans le tube de deux millilitres contenant le reste de la suspension cellulaire ISE6.
Ensuite, centrifuger l’échantillon à température ambiante, d’abord à 700 G pendant deux minutes pour tirer vers le bas les cellules ISE6, puis à 13, 600 G pendant une minute pour tirer vers le bas les rickettsies. Incuber le tube à 34 degrés Celsius pendant 15 minutes à une heure. Après incubation, transférer le contenu remis en suspension d’une transformation dans une fiole de culture cellulaire de 25 centimètres carrés contenant 3,5 millilitres de milieu frais avec du bicarbonate de sodium et un tampon HEPES.
Balancer le ballon pour répartir uniformément le mélange et incuber à 34 degrés Celsius. Après 16 à 24 heures, ajouter 10 microlitres de spectinomycine et de streptomycine dans la fiole incubée. Balancer la fiole pour mélanger uniformément les antibiotiques dans le milieu avant de remettre la fiole dans l’incubateur.
La propagation réussie des cellules sauvages de Rickettsia parkeri et ISE6 a été mise en évidence par la coloration de Giemsa. Les noyaux des cellules ISE6 colorés en violet foncé avec Giemsa dans les ricketts intracellulaires et extracellulaires sont visibles. La transformation de Rickettsia parkeri exprimant la protéine de fluorescence rouge dans les cellules ISE6 a été confirmée par microscopie confocale après sept jours d’incubation.
Une augmentation substantielle du taux d’infection a été observée après 10 jours. Gardez tout stérile pendant toute la procédure. Faites attention aux détails et soyez patient, car certaines espèces de rickettsies mettent beaucoup de temps à se transformer, en particulier les endosymbiotes à croissance lente.
Ce protocole a permis l’étude de multiples aspects de la biologie des rickettsies et de leurs interactions avec leurs arthropodes vecteurs et leurs hôtes mammifères. Par exemple, des rickettsis exprimant des protéines fluorescentes ont été utilisés pour suivre la motilité et les interactions symbiotiques entre les cellules des tiques.
