Estudos funcionais dos genes Rickettsia são cruciais para a compreensão de seu papel na patogênese, por isso precisamos de métodos confiáveis de alteração dos genes de forma controlada. Nosso protocolo usa eletroporação para introduzir DNA exógeno em bactérias intracelulares obrigatórias do gênero Rickettsia, permitindo-nos estudar os efeitos do DNA introduzido. Demonstrando o procedimento junto comigo hoje estará Lisa Price, pesquisadora do Dr. Munderloh e do laboratório do Dr. Kurtti.
Para começar, prepare uma cultura de células ISE6 infectada por 90 a 100% Rickettsia parkeri, conforme descrito no texto. Em seguida, para determinar a taxa de infecção pela coloração de Giemsa, diluir a suspensão celular para uma proporção de 1:5 com meio completo e depositar 100 microlitros da suspensão celular em uma lâmina de microscópio de vidro por centrifugação a 113 G por cinco minutos. Depois de deixar a lâmina secar ao ar, fixe-a em metanol absoluto por cinco minutos à temperatura ambiente.
Em seguida, incube a lâmina e a mancha de Giemsa por 30 minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, lave a lâmina em água e, uma vez seca, visualize-a sob um microscópio de luz com objetivas de óleo. Determine a porcentagem de células infectadas contando as células infectadas e não infectadas.
Para preparar o Rickettsia parkeri livre de células, despeje cerca de 0,2 mililitros de grão de carboneto de silício estéril de 60 a 90 em dois tubos de microcentrífuga estéreis de dois mililitros e deixe os tubos de lado. De um frasco previamente inoculado de Rickettsia parkeri infectado contendo cinco mililitros de meio, remova dois mililitros do meio, tomando cuidado para não perturbar a camada celular. Em seguida, ressuspenda as células com os três mililitros restantes do meio.
Divida esta suspensão igualmente entre os dois tubos de grão de carboneto de silicone preparados e vortex o tubo em alta velocidade por 30 segundos. Em seguida, coloque-os no gelo. Em seguida, prepare uma seringa estéril de cinco mililitros luer lock, estendendo o êmbolo e insira a extremidade do êmbolo em uma base de poliestireno usada para segurar tubos cônicos de 15 mililitros.
Usando uma pipeta Pasteur de barreira de dois mililitros operada com um bulbo de borracha, remova cuidadosamente o sobrenadante das células do vórtice sem aspirar qualquer grão. Em seguida, insira a ponta da pipeta na abertura do cubo da seringa e ejete o conteúdo para a seringa com uma pressão suave. Em seguida, filtre a cultura de Rickettsia parkeri em tubos estéreis de 1,5 mililitro através de um filtro estéril de tamanho de poro de dois micrômetros instalado no cubo da seringa e centrifugar os tubos a 13.600 G por cinco minutos a quatro graus Celsius.
Depois de remover o sobrenadante, lave o pellet de célula duas vezes com 1,2 mililitros de solução de sacarose gelada de 300 milimolares. Centrifugar a amostra e remover o sobrenadante entre as lavagens. No final da centrifugação, ressuspender o pellet de células agrupadas com 100 a 150 microlitros de solução de sacarose gelada para duas a três amostras de transformação, respectivamente.
Em seguida, divida a amostra em alíquotas de 50 microlitros em tubos de microcentrífuga pré-refrigerados, estéreis e de 1,5 microlitro. Para transformação em três microgramas de DNA plasmidial pRAM18sSFA livre de endotoxinas para cada tubo contendo 50 microlitros de Rickettsia parkeri no gelo e mexa suavemente com uma ponta de pipeta. Transfira a mistura para uma cubeta de eletroporação estéril pré-resfriada com um tamanho de folga de 0,1 centímetro.
Bata suavemente na cubeta para distribuir a mistura uniformemente e incube no gelo por 10 a 30 minutos. Entretanto, retire o meio de um balão de cultura celular ISE6 previamente cultivado e ressuspenda a camada celular enxaguando suavemente as células com 1,5 mililitros de meio fresco contendo bicarbonato de sódio e tampão HEPES. Depois de gerar uma suspensão celular homogênea, transfira todo o volume para um único tubo de microcentrífuga estéril de dois mililitros.
Em seguida, eletroporate a mistura de Rickettsia parkeri e DNA plasmídico usando um eletroporador. Após a eletroporação, use uma pipeta de ponta fina estendida estéril para transferir uma pequena quantidade da suspensão de células ISE6 para a cubeta e pipetar suavemente para cima e para baixo para recuperar a Rickettsia parkeri eletroporada. Em seguida, transfira o conteúdo da cubeta para o tubo de dois mililitros contendo o restante da suspensão celular ISE6.
Em seguida, centrifugar a amostra à temperatura ambiente, primeiro a 700 G por dois minutos para puxar as células ISE6 e, em seguida, a 13.600 G por um minuto para puxar a Rickettsia. Incubar o tubo a 34 graus Celsius por 15 minutos a uma hora. Após incubação, transferir o conteúdo ressuspenso de uma transformação para um balão de cultura celular de 25 centímetros quadrados contendo 3,5 mililitros de meio fresco com bicarbonato de sódio e tampão HEPES.
Agite o balão para espalhar a mistura uniformemente e incubar a 34 graus Celsius. Após 16 a 24 horas, adicionar 10 microlitros cada de espectinomicina e estreptomicina ao balão incubado. Agite o balão para misturar os antibióticos uniformemente no meio antes de devolver o balão à incubadora.
A propagação bem-sucedida de células selvagens de Rickettsia parkeri e ISE6 foi evidente pela coloração de Giemsa. Os núcleos das células ISE6 corados de roxo escuro com Giemsa no Rickettsi intracelular e extracelular são visíveis. A transformação de Rickettsia parkeri expressando a proteína de fluorescência vermelha em células ISE6 foi confirmada por microscopia confocal após sete dias de incubação.
Um aumento substancial na taxa de infecção foi observado após 10 dias. Mantenha tudo estéril durante todo o procedimento. Preste atenção aos detalhes e seja paciente, pois algumas espécies de Rickettsia levam muito tempo para se transformar, especialmente os endossimbiontes de crescimento lento.
Este protocolo permitiu o estudo de múltiplos aspectos da biologia de Rickettsia e suas interações com seus vetores artrópodes e hospedeiros mamíferos. Por exemplo, Rickettsi fluorescente que expressa proteínas tem sido usado para rastrear a motilidade e as interações simbiontes das células do carrapato.
