生成用于药物评估研究的 3D 肿瘤微球

该协议展示了构建球状体三维肿瘤的标准化方法。这种方法提供了3D肿瘤构建体的高回路和高内涵分析。通过使用肿瘤球体构建的标准方法和高通量成像和分析系统，可以显着提高在三维球体上形成的药物测试的有效性和准确性。

在该协议中，我们使用AMG510处理NCI-H23球体为例。从实验中，我们可以观察到癌靶药物对肿瘤球状体的显着影响。首先，将100微升抗粘附试剂移液到具有U形孔底的48孔板的每个孔中并保持10分钟。

10分钟后，吸出涂层试剂并用无菌PBS洗涤两次。将培养板置于37摄氏度的培养箱中，在含有5%二氧化碳的潮湿空气中直至使用。在显微镜下观察细胞。

然后，用PBS洗涤在T25烧瓶中培养的细胞两次以除去培养基，并在37摄氏度，5%二氧化碳的培养箱中用一毫升0.25%胰蛋白酶EDTA处理扩增的细胞一至两分钟。在显微镜下确认细胞形状。然后通过在T25烧瓶中吸入用过的胰蛋白酶EDTA悬浮液并用4毫升新鲜培养基洗涤细胞来停止胰蛋白酶处理。

将所有悬浮液转移到15毫升管中，并使用一毫升新鲜培养基冲洗残留细胞并将其添加到管中。在室温下以186.48G离心细胞五分钟，弃去上清液。向细胞沉淀中加入10毫升新鲜培养基，轻轻移液，直到细胞处于均匀的悬浮液中。

将0.1毫升细胞悬液吸入新的离心管中。加入0.9毫升新鲜培养基，然后充分移液悬浮液。提取10微升细胞悬液进行细胞计数。

重复此过程一次或两次并取平均值。稀释悬浮液以达到每毫升50， 000个细胞的最终接种密度。接下来，将 200 微升细胞悬液添加到 48 孔 U 底板的每个孔中。

将密封膜缠绕在板上，并在室温下以119.35G离心五分钟。离心后，拉下保护膜，将五至八毫升灭菌水加入井周围的水道中。将板在 37 摄氏度下孵育五天。

在此期间不要向水通道更换或补充任何水，并在接下来的五天内观察细胞聚集。对于凝胶包埋，从零下20摄氏度的冰箱中取出冷冻凝胶后，在实验过程中将其整个时间放在冰盒上。在显微镜下观察细胞球状体。

在凝胶包埋开始之前，应再次检查微球的状态。小心地除去150微升培养基，并通过从孔壁侧缓慢添加液体凝胶，同时将预冷移液器吸头在孔周围和内部移动，将每个球体嵌入凝胶中。等待五分钟，如果凝胶没有均匀扩散，请用 10 微升移液器吸头轻轻移液凝胶。

每个孔包含一个肿瘤球体、25微升3.5毫克/毫升凝胶和50微升完全培养基。向对照中也加入 75 微升培养基。将板在37摄氏度下孵育30分钟，直到水凝胶完全完成。

在显微镜下确认凝胶状态。在每个样品上覆盖125微升新鲜培养基，并将球状体再培养7至10天。准备每组有四到六个孔的球体，并选择至少三个进行分析。

根据制造商的说明溶解药物，并用DMSO制备100倍工作溶液。使用0.1%DMSO作为阳性对照，并向每个孔中加入125微升药物治疗培养基。将板放回培养箱中，在含有5%二氧化碳的潮湿空气中，温度为37摄氏度。

在此阶段，每个孔包含一个肿瘤球状体，25微升3.5毫克/毫升凝胶和175微升培养基。对照包含 200 微升培养基。根据制造商的指南，使用alamarBlue检测试剂盒测量球体活力。

从每个孔中吸取100微升上清液培养基到新的测试板中。然后，使用微孔板光度计测量活性。在将微球嵌入凝胶后的第1天，第4天，第7天和第10天进行测量。

向培养板的每个孔中加入80微升新鲜培养基。然后更换另外100微升药物治疗的培养基。确保井中没有阿拉马尔蓝的残留物。

成像前吸出100微升培养基，并将板放在载物台上。使用具有十倍物镜的自动显微镜获得微球的数字图像。显微镜可以自动聚焦和集中这些球体。

等待自动成像。为每个微球获取四个图像。使用连接到高内涵成像系统的软件形成和处理集成图像。

单击映像修补过程按钮，然后在软件中选择集成映像。选择U净模型并输入转化率。单击屏幕底部以开始图像处理。

将直径、周长和粗糙度数据保存在电子表格软件中。最后，用药物加入100微升新鲜培养基，并将板放回含有5%二氧化碳的潮湿空气中的37摄氏度培养箱中。用不同浓度的AMG510处理并由高内涵显微镜自动捕获的NCI-H23细胞球体的明场图像如图所示。

列表示不同的日期，行表示不同的药物浓度。结果包括每个条件的三个球体。在第1天，第4天，第7天和第10天测量AMG510处理样品组的肿瘤球状体活力。

具有浓度梯度的样品的终细胞活力如图所示。在第1天，第4天，第7天和第10天测量肿瘤球体直径。球体生长比定义为相对于原始体积的终端体积，并使用球体直径计算。

相对于体积定义球体生长抑制比，并使用球体直径计算。在第1天、第4天、第7天和第10天用软件测量肿瘤粗糙度，表明肿瘤球状体的侵袭性。球体的周长由软件使用深度学习算法定位和绘制。

然后通过图像J测量焦平面上的球体区域，并根据这些数据计算多余的周长指数。尽管此消息很容易遵循，但仍然需要仔细处理示例。