流式细胞术 检测 接种乙型脑炎疫苗的儿童多功能T细胞

对乙型脑炎病毒特异性TPFS的检测方法和流式细胞术配色方案进行了测试，为类似研究提供参考。演示该程序将由我们实验室的两名学生张琳琳和张萌进行。首先，在单克隆抗体CD28和CD49d，CD107a，GolgiPlug和monensin存在下，用浓缩的灭活JEV颗粒在37摄氏度下刺激JEV刺激组的PBMC16小时。

然后，在单克隆抗体CD28和CD49d，CD 107a，GolgiPlug和monensin存在下，在37摄氏度下刺激没有浓缩病毒颗粒的对照组的PBMC16小时。将每组的细胞悬液收集在1.5毫升微量离心管中。在室温下以500g离心5分钟，然后用移液管除去上清液。

将细胞重悬于1毫升PBS中。将可固定的活性染料添加到细胞悬液中，并在室温下在黑暗中孵育10分钟。在室温下以500g离心五分钟，并除去上清液。

将细胞重悬于1毫升PBS中后，再次在室温下以500g离心5分钟，并如前所述弃去上清液。为了进行细胞表面标志物染色，将细胞重悬于100微升PBS中，并在每个管中的细胞悬液中加入两微升每种表面标志物抗体。将试管在室温下孵育 30 分钟，同时保护它们免受光照。

以500g离心五分钟，并如前所述除去上清液。再次，将细胞重悬于一毫升PBS中。在室温下以500g离心五分钟，然后小心地弃去上清液。

为了进行固定和膜破裂，用500微升破膜固定溶液重悬细胞，并在室温下在黑暗中固定细胞20分钟。然后以500g离心五分钟，除去上清液。将细胞重悬于一毫升PBS中后，在室温下以500g离心五分钟，并小心除去上清液，如前所述。

然后，将细胞重悬于100微升PBS中，并在每管中的细胞悬液中加入2微升每种细胞因子抗体以进行细胞内细胞因子染色。将试管在室温下在黑暗中孵育30分钟。再次，以500g离心五分钟，并如前所述除去上清液。

再次将细胞重悬于一毫升PBS中。在室温下以500g离心5分钟，并如前所述小心除去上清液。然后，加入500微升PBS以重悬细胞。

如前所述，单独分离PBMC样品后，将细胞悬液在手稿中描述的1.5毫升微量离心管中分成12等份。类似地，如前所述，在加入细胞表面标志物和细胞内细胞因子抗体后，加入500微升PBS以重悬细胞并以低速涡旋。使用未染色的样品，调整前向散射、侧向散射和不同的荧光染料电压，同时调整流式细胞术补偿以消除不同荧光团之间的污染信号，使用单个染色样品。

通过前向散射区绘制多边形门，侧向散射区点图选择完整的淋巴细胞群，同时排除碎片，并通过前向散射区绘制矩形门，前向散射宽度点图选择单个细胞。接下来，通过活的矩形门绘制一个矩形门，死边散射区点图以选择活细胞，并通过CD3侧散射区点图绘制一个矩形门以识别CD中的三个阳性T细胞。然后，通过CD4，CD8点图绘制四栅门以识别CD4阳性或CD8阳性T细胞，并通过CD45RO，CD27点图将CD4阳性或CD8阳性T细胞细分为TCM和TEM。

在抽取CD107a门后，干扰素γ、肿瘤坏死因子α、白细胞介素2和小噬细胞炎症蛋白一α分别从中医或透射电镜中取出CD8阳性或CD4阳性T细胞，分别确定不同反应模式的频率。将样品依次加载到细胞仪上。采用门控策略，先用前向散射面积宽度，然后侧向散射区域点图鉴定CD8阳性或CD4阳性T细胞及其亚群的TCM或TEM。

CD4阳性和CD8阳性T细胞对JEV应答的多功能表征表明，与未接种疫苗的儿童相比，接种疫苗的儿童在JEV刺激后CD8阳性中医细胞中检测到CD107a，干扰素γ，肿瘤坏死因子α和白细胞介素2水平升高。然而，两组巨噬细胞炎症蛋白一α的水平没有差异。与未接种疫苗组相比，在JEV刺激下，接种疫苗组的CD8阳性TEM细胞中检测到更高水平的CD107a和干扰素γ。

而肿瘤坏死因子α，白细胞介素2和巨噬细胞炎症蛋白α在这些阳性细胞中没有显着升高。与未接种组相比，JEV抗原成功诱导接种组CD4阳性中药细胞CD107a、干扰素γ、肿瘤坏死因子α和巨噬细胞炎症蛋白1α水平较高。然而，在JEV刺激下，两组白细胞介素2阳性细胞的比例没有差异。

在JEV存在下，接种组CD107a阳性、干扰素γ阳性和肿瘤坏死因子α阳性亚群、亚CD4阳性TEM细胞的比例高于未接种组。刺激的T细胞免疫原性和兼容的颜色匹配策略是该协议中的关键步骤。