基于刀豆球蛋白A的沉降测定法，用于测量葡聚糖磷酸酶的底物结合

这种基于刀豆球蛋白A的体外沉降测定旨在测量葡聚糖磷酸酶对不同STA底物的结合亲和力。我们从这种方法中获得的信息对于我们理解葡聚糖磷酸酶家族至关重要。碳水化合物蛋白相互作用相对较弱，因此目前的方法无法检测葡聚糖磷酸酶和葡聚糖相互作用。

我们基于凝集素的共沉降测定可以检测毫摩尔范围内的结合亲和力。SEX4突变体以及葡聚糖磷酸酶家族的其他成员的表征证明了该测定定量蛋白质碳水化合物相互作用的能力。测定中最具挑战性的部分之一是优化底物的浓度范围。

我们建议从更广泛的范围开始以获得想法，然后缩小特定范围。首先，将250微升ConA琼脂糖珠悬浮液移入1.5毫升微量离心管中。将内容物在10， 000 G下在4摄氏度下离心30秒。

弃去上清液后，向含有250微升ConA琼脂糖珠的每个管中加入750微升结合缓冲液。将试管在10， 000 G下在4摄氏度下离心一分钟，然后除去上清液。接下来，制备两倍稀释的溶解支链淀粉溶液，制成一系列两毫升稀释的支链淀粉溶液。

为了制备ConA琼脂糖支链淀粉珠，将250微升每种稀释的支链淀粉溶液加入含有250微升ConA琼脂糖珠预平衡和结合缓冲液的管中。充分混合内容物，并用相应的支链淀粉浓度标记试管。将试管内容物在4摄氏度的旋转轮上孵育30分钟，并以10， 000G离心管1分钟。

将 250 微升 ConA-琼脂糖支链淀粉珠与 100 微升含有 10 微克淀粉过量 4 或 SEX4 蛋白、10 毫摩尔二硫苏糖醇和 10 微摩尔蛋白酶抑制剂混合物的结合缓冲液混合。将内容物在 4 摄氏度下轻轻旋转孵育 45 分钟。然后将试管以10， 000G离心一分钟，并小心地将50微升上清液移入新的1.5毫升微量离心管中。

向含有50微升收集的上清液级分的每个管中加入20微升4X SDS页面染料和10微升蒸馏水，并将其标记为S.同样，将20微升4X SDS页面染料和80微升蒸馏水加入含有洗涤的ConA琼脂糖支链淀粉SEX4珠子的管中。加入染料和水后，将所有样品在 95 摄氏度下加热 10 分钟。将ConA-琼脂糖支链淀粉SEX4珠以10， 000 G离心一分钟后，保存上清液并将其标记为P.Load 40微升标记为S的未结合蛋白质样品从最低底物浓度到最高底物浓度到4至12%预制聚丙烯酰胺凝胶孔中，为蛋白质分子量标记物保留第一泳道。

使用第二块凝胶加载标记为P.的葡聚糖结合蛋白样品，将新鲜制备的SDS页电泳缓冲液添加到设备的两个腔室中，并以150伏电泳凝胶35分钟或直到染料前沿到达凝胶底部。然后从仪器中取出凝胶盒并取出垫片和玻璃板以分离凝胶以进行蛋白质印迹分析。制作一升转膜缓冲液，含有 5.8 克 tris 碱、2.9 克甘氨酸、0.37 克 SDS 和 200 毫升甲醇。

要将大小分离的蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶转移到硝酸纤维素膜上，请根据蛋白质免疫印迹转印方案组装海绵、滤纸、凝胶和硝酸纤维素膜，并在 70 伏下运行一小时。运行凝胶后，将硝酸纤维素膜在50毫升TBST缓冲液中1至5%牛血清白蛋白或乳蛋白的蛋白质溶液中孵育一小时，以防止非特异性蛋白质结合。使用TBST缓冲液洗涤膜三次，以除去任何未结合的封闭溶液。

接下来，将膜与组氨酸标记蛋白特异性稀释的辣根过氧化物酶连接抗体孵育一小时。然后在TBST缓冲液中洗涤膜三次，以去除任何未结合的抗体。对于数字成像，将等份的化学发光底物溶液制成溶液，每个750微升在1.5毫升管中，并将膜在溶液中孵育至少五分钟。

将膜蛋白面朝下放在印迹扫描仪上，然后运行采集软件以定量沉淀和上清液级分中的蛋白质。要获取数据，请使用带有印迹扫描仪的采集软件开始定量信号测量。将上清液和沉淀级分中的所有定量测量标准化为上样的总蛋白质。

在饱和结合实验中，绘制蛋白质结合与支链淀粉浓度的百分比，并使用数据分析软件拟合数据以计算解离常数Kd.使用SDS页分析SEX4与ConA-琼脂糖支链淀粉珠的结合能力。注意到沉淀级分中存在SEX4蛋白，上清液级分中存在牛血清白蛋白。W278A是一种已知的SEX4突变体，具有显着降低的葡聚糖结合能力，出现在上清液级分中，表明该测定的效用和特异性。

蛋白质印迹分析显示SEX4的检测显著增加，该方法特异性地用于检测具有末端组氨酸标签的葡聚糖磷酸盐。共沉降测定在三种不同的SEX4浓度下进行测试。虽然2微克SEX4足以通过化学发光检测进行可视化，但使用5或10微克SEX4可以进行更准确的检测。

此外，注意到SEX4结合增加与支链淀粉浓度增加。测定支链淀粉和SEX4野生型蛋白在不同浓度下的结合亲和力，并将蛋白质与特定位点结合模型的结合百分比数据给出的Kd约为1.03毫克/毫升。评估该方法测量马铃薯淀粉、LSF2、玉米SEX4和马铃薯SEX4与马铃薯支链淀粉结合的适用性。

结果表明，来自农艺重要作物的测试蛋白质也与支链淀粉不同结合。记住沉淀和上清液级分中所有定量测量值与总上样蛋白的标准化至关重要。为确保所有支链淀粉都与磁珠结合，请保存上清液级分以便稍后进行深层葡萄糖测定。

葡聚糖磷酸酶采用不同的机制来结合、定位和去磷酸化碳水化合物。该方法允许探索葡聚糖磷酸酶与大型聚合物复合物中不同结构域的结合，以实现位置特异性去磷酸化。