Dieser Concanavalin-A-basierte In-vitro-Sedimentationsassay wurde entwickelt, um die Bindungsaffinität von Glucanphosphatasen gegen verschiedene STA-Substrate zu messen. Die Informationen, die wir aus dieser Methode gewinnen, sind grundlegend für unser Verständnis der Glucan-Phosphatase-Enzymfamilie. Die Wechselwirkungen zwischen Kohlenhydratproteinen sind relativ schwach, so dass die derzeitigen Methoden die Wechselwirkungen zwischen Glucanphosphatase und Glucan nicht nachweisen können.
Unser lektinbasierter Cosedimentationsassay kann eine Bindungsaffinität im millimolaren Bereich nachweisen. Die Charakterisierung von SEX4-Mutanten sowie anderen Mitgliedern der Glucan-Phosphatase-Familie von Enzymen demonstriert die Fähigkeit dieses Assays, Protein-Kohlenhydrat-Interaktionen zu quantifizieren. Einer der schwierigsten Teile des Assays besteht darin, den Konzentrationsbereich des Substrats zu optimieren.
Wir empfehlen, mit einem breiteren Bereich zu beginnen, um sich ein Bild zu machen, und dann auf einen bestimmten Bereich einzugrenzen. Pipettieren Sie zunächst 250 Mikroliter ConA-Sepharose-Beads-Suspension in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie den Inhalt bei 10.000 g für 30 Sekunden bei vier Grad Celsius.
Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, geben Sie 750 Mikroliter des Bindungspuffers in jedes Röhrchen mit 250 Mikrolitern ConA-Sepharose-Kügelchen. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 10.000 G eine Minute lang bei vier Grad Celsius und entfernen Sie den Überstand. Als nächstes bereiten Sie zweifache Verdünnungen der solubilisierten Amylopektinlösung vor, um eine Reihe von zwei Millilitern verdünnten Amylopektinlösungen herzustellen.
Zur Herstellung der ConA-Sepharose-Amylopektin-Kügelchen werden 250 Mikroliter jeder verdünnten Amylopektin-Lösung in die Röhrchen gegeben, die 250 Mikroliter ConA-Sepharose-Kügelchen mit Voräquilibrierung und Bindungspuffer enthalten. Mischen Sie den Inhalt gut und beschriften Sie die Röhrchen mit der entsprechenden Amylopektinkonzentration. Inkubieren Sie den Röhrcheninhalt auf einem rotierenden Rad bei vier Grad Celsius für 30 Minuten und zentrifugieren Sie die Röhrchen eine Minute lang bei 10.000 G.
Mischen Sie 250 Mikroliter ConA-Sepharose-Amylopektin-Kügelchen mit 100 Mikrolitern des Bindungspuffers, der 10 Mikrogramm überschüssige Stärke oder SEX4-Protein, 10 Millimolar Dithiothreitol und 10 Mikromolar Proteasehemmer-Cocktail enthält. Inkubieren Sie den Inhalt bei vier Grad Celsius für 45 Minuten unter sanfter Rotation. Anschließend werden die Röhrchen bei 10.000 G eine Minute lang zentrifugiert und 50 Mikroliter des Überstands vorsichtig in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen pipettiert.
Geben Sie 20 Mikroliter 4X SDS-Seitenfarbstoff und 10 Mikroliter destilliertes Wasser in jedes Röhrchen, das 50 Mikroliter der gesammelten Überstandsfraktionen enthält, und kennzeichnen Sie sie als S. Geben Sie in ähnlicher Weise 20 Mikroliter 4X SDS-Seitenfarbstoff und 80 Mikroliter destilliertes Wasser in die Röhrchen mit gewaschenen ConA-Sepharose-Amylopektin-SEX4-Kügelchen. Nach Zugabe von Farbstoff und Wasser erhitzen Sie alle Proben 10 Minuten lang bei 95 Grad Celsius. Nachdem die ConA-Sepharose-Amylopektin SEX4-Kügelchen eine Minute lang bei 10.000 G zentrifugiert wurden, bewahren Sie den Überstand auf und markieren Sie ihn als P.Laden Sie 40 Mikroliter der ungebundenen Proteinproben, die als S gekennzeichnet sind, in 4 bis 12 % vorgefertigte Polyacrylamidgel-Vertiefungen von der niedrigsten bis zur höchsten Substratkonzentration, wobei die erste Spur für einen Proteinmolekulargewichtsmarker reserviert wird.
Verwenden Sie ein zweites Gel, um die mit P gekennzeichneten Glucan-gebundenen Proteinproben zu laden.Geben Sie frisch vorbereiteten SDS-Puffer in beide Kammern der Apparatur und lassen Sie das Gel 35 Minuten lang mit 150 Volt laufen oder bis die Farbstofffront den Boden des Gels erreicht. Nehmen Sie dann die Gelkassette aus dem Gerät und entfernen Sie die Abstandshalter und Glasplatten, um das Gel für die Western-Blot-Analyse zu trennen. Stellen Sie einen Liter Transferpuffer her, der 5,8 Gramm Trisbase, 2,9 Gramm Glycin, 0,37 Gramm SDS und 200 Milliliter Methanol enthält.
Um die größengetrennten Proteine aus dem Polyacrylamid-Gel auf eine Nitrozellulose-Membran zu übertragen, werden die Schwämme, das Filterpapier, das Gel und die Nitrozellulose-Membran gemäß dem westlichen Transferprotokoll zusammengebaut und eine Stunde lang mit 70 Volt betrieben. Inkubieren Sie die Nitrozellulosemembran nach dem Laufen des Gels in einer Proteinlösung aus 1 bis 5 % Rinderserumalbumin oder Milchprotein in 50 Millilitern TBST-Puffer für eine Stunde, um eine unspezifische Proteinbindung zu verhindern. Waschen Sie die Membran dreimal mit TBST-Puffer, um ungebundene Blockierungslösung zu entfernen.
Als nächstes inkubieren Sie die Membran eine Stunde lang mit dem verdünnten Meerrettichperoxidase-gebundenen Antikörper, der für das Histidin-markierte Protein spezifisch ist. Waschen Sie die Membran dann dreimal mit TBST-Puffer, um ungebundene Antikörper zu entfernen. Für die digitale Bildgebung stellen Sie eine Lösung aus gleichen Teilen chemilumineszierender Substratlösungen her, jeweils 750 Mikroliter in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen, und inkubieren Sie die Membran mindestens fünf Minuten lang in der Lösung.
Legen Sie das Membranprotein mit der Seite nach unten auf den Blot-Scanner und führen Sie die Erfassungssoftware aus, um das Protein sowohl in der Pellet- als auch in der Überstandsfraktion zu quantifizieren. Um die Daten zu erfassen, starten Sie die quantitativen Signalmessungen mit der Erfassungssoftware mit dem Blot-Scanner. Normalisieren Sie alle quantitativen Messungen in den Überstands- und Pelletfraktionen auf das insgesamt beladene Protein.
Im Sättigungsbindungsexperiment wird der Prozentsatz der Proteinbindung im Vergleich zur Amylopektinkonzentration aufgetragen und die Daten mithilfe einer Datenanalysesoftware angepasst, um die Dissoziationskonstante Kd zu berechnen.Die Bindungskapazität von SEX4 an ConA-Sepharose-Amylopektin-Beads wurde mit Hilfe der SDS-Seite analysiert. Das Vorhandensein von SEX4-Protein in der Pelletfraktion und Rinderserumalbumin in der Überstandsfraktion wurde festgestellt. W278A, eine bekannte SEX4-Mutante mit signifikant reduzierter Glucanbindungsfähigkeit, erschien in der Überstandsfraktion, was auf den Nutzen und die Spezifität dieses Assays hinweist.
Die Western-Blotting-Analyse ergab einen signifikanten Anstieg der Detektion von SEX4 und die Methode ist spezifisch für den Nachweis von Glucanphosphaten mit einem endterminalen Histidin-Tag. Der Cosedimentationsassay wurde bei drei verschiedenen SEX4-Konzentrationen getestet. Während zwei Mikrogramm SEX4 ausreichen, um durch Chemilumineszenz-Detektion sichtbar zu machen, ermöglicht die Verwendung von fünf oder 10 Mikrogramm SEX4 eine genauere Detektion.
Außerdem wurde eine erhöhte SEX4-Bindung bei erhöhter Amylopektinkonzentration festgestellt. Die Bindungsaffinität von Amylopektin und SEX4-Wildtyp-Protein in verschiedenen Konzentrationen wurde bestimmt, und die prozentualen proteingebundenen Daten für das spezifische Bindungsmodell an einer Stelle ergaben einen Kd von etwa 1,03 Milligramm pro Milliliter. Die Anwendbarkeit dieser Methode zur Messung der Bindung von Laforin, LSF2, Mais SEX4 und Kartoffel-SEX4 gegen Kartoffel-Amylopektin wurde untersucht.
Die Ergebnisse zeigten, dass die getesteten Proteine aus agronomisch wichtigen Nutzpflanzen auch differentiell an Amylopektin gebunden sind. Es ist wichtig, sich an die Normalisierung aller quantitativen Messungen in den Pellet- und Überstandsfraktionen auf das insgesamt beladene Protein zu erinnern. Um sicherzustellen, dass das gesamte Amylopektin an die Kügelchen gebunden ist, bewahren Sie die überstehenden Fraktionen auf, um später den Tiefenglukosetest durchzuführen.
Die Glucanphosphatase wird durch verschiedene Mechanismen zur Bindung, Lokalisierung und Dephosphorylierung von Kohlenhydraten eingesetzt. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der Bindung der Glucanphosphatase an verschiedene strukturelle Domänen innerhalb großer Polymerkomplexe zur positionsspezifischen Dephosphorylierung.
