Ce test de sédimentation in vitro à base de concanavaline A est conçu pour mesurer l’affinité de liaison des phosphatases glucanes contre différents substrats STA. L’information que nous obtenons de cette méthode est fondamentale pour notre compréhension de la famille des enzymes de la phosphatase glucane. Les interactions entre les protéines glucidiques sont relativement faibles, de sorte que les méthodes actuelles ne peuvent pas détecter les interactions entre la phosphatase glucane et le glucane.
Notre test de cosédimentation à base de lectine peut détecter l’affinité de liaison dans la gamme millimolaire. La caractérisation des mutants SEX4 ainsi que d’autres membres de la famille des enzymes phosphatases glucanes démontre la capacité de ce test à quantifier les interactions entre les protéines glucidiques. L’une des parties les plus difficiles du test consiste à optimiser la plage de concentration du substrat.
Nous vous recommandons de commencer par une gamme plus large pour vous faire une idée, puis de réduire pour une gamme spécifique. Pour commencer, pipeter 250 microlitres de suspension de billes de ConA-sépharose dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. Centrifuger le contenu à 10 000 G pendant 30 secondes à quatre degrés Celsius.
Après avoir jeté le surnageant, ajoutez 750 microlitres du tampon de liaison à chaque tube contenant 250 microlitres de billes de ConA-sépharose. Centrifuger les tubes à 10 000 G pendant une minute à quatre degrés Celsius et retirer le surnageant. Ensuite, préparez deux dilutions de la solution d’amylopectine solubilisée pour obtenir une série de solutions d’amylopectine diluées de deux millilitres.
Pour préparer les billes d’amylopectine ConA-sépharose, ajouter 250 microlitres de chaque solution d’amylopectine diluée aux tubes contenant 250 microlitres de billes de ConA-sépharose prééquilibrées et tampon de liaison. Bien mélanger le contenu et étiqueter les tubes avec la concentration d’amylopectine correspondante. Incuber le contenu du tube sur une roue rotative à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes et centrifuger les tubes à 10 000 G pendant une minute.
Mélanger 250 microlitres de billes d’amylopectine ConA-sépharose avec 100 microlitres du tampon de liaison contenant 10 microgrammes d’amidon en excès quatre, ou protéine SEX4, 10 millimolaires de dithiothréitol et 10 micromolaires de cocktail inhibiteur de protéase. Incuber le contenu à quatre degrés Celsius pendant 45 minutes en tournant doucement. Ensuite, centrifugez les tubes à 10 000 G pendant une minute et pipettez soigneusement 50 microlitres du surnageant dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 millilitre.
Ajoutez 20 microlitres de colorant de page 4X SDS et 10 microlitres d’eau distillée à chaque tube contenant 50 microlitres des fractions surnageantes collectées et étiquetez-les comme S.De même, ajoutez 20 microlitres de colorant de page 4X SDS et 80 microlitres d’eau distillée dans les tubes contenant des billes d’amylopectine ConA-sépharose SEX4 lavées. Après avoir ajouté du colorant et de l’eau, chauffer tous les échantillons à 95 degrés Celsius pendant 10 minutes. Une fois que les billes d’amylopectine SEX4 de ConA-sépharose sont centrifugées à 10 000 G pendant une minute, conservez le surnageant et étiquetez-le comme P.Chargez 40 microlitres des échantillons de protéines non liés étiquetés comme S dans 4 à 12% de puits de gel de polyacrylamide préfabriqué de la concentration de substrat la plus faible à la plus élevée, en réservant la première voie pour un marqueur de poids moléculaire de la protéine.
Utilisez un deuxième gel pour charger les échantillons de protéines liées au glucane étiquetés P.Ajouter un tampon de page SDS fraîchement préparé aux deux chambres de l’appareil et faire fonctionner le gel à 150 volts pendant 35 minutes ou jusqu’à ce que le front de colorant atteigne le fond du gel. Ensuite, retirez la cassette de gel de l’appareil et retirez les entretoises et les plaques de verre pour séparer le gel pour l’analyse par transfert Western. Faites un litre de tampon de transfert contenant 5,8 grammes de tris base, 2,9 grammes de glycine, 0,37 grammes de FDS et 200 millilitres de méthanol.
Pour transférer les protéines séparées par la taille du gel de polyacrylamide à une membrane de nitrocellulose, assemblez les éponges, les papiers filtres, le gel et la membrane de nitrocellulose selon le protocole de transfert Western et faites fonctionner à 70 volts pendant une heure. Après avoir fait couler le gel, incuber la membrane de nitrocellulose dans une solution protéique de 1 à 5% d’albumine sérique bovine ou de protéines de lait dans 50 millilitres de tampon TBST pendant une heure pour éviter la liaison aux protéines non spécifiques. Lavez la membrane trois fois à l’aide d’un tampon TBST pour éliminer toute solution bloquante non liée.
Ensuite, incuber la membrane pendant une heure avec l’anticorps dilué lié à la peroxydase de raifort spécifique de la protéine marquée à l’histidine. Ensuite, lavez la membrane trois fois dans un tampon TBST pour éliminer tous les anticorps non liés. Pour l’imagerie numérique, fabriquez une solution de parties égales de solutions de substrat chimiluminescentes, 750 microlitres chacune dans un tube de 1,5 millilitre, et incuber la membrane pendant au moins cinq minutes dans la solution.
Placez le côté de la protéine membranaire vers le bas sur le scanner de transfert et exécutez le logiciel d’acquisition pour quantifier la protéine dans les fractions de granulés et de surnageants. Pour acquérir les données, démarrez les mesures quantitatives du signal à l’aide du logiciel d’acquisition avec le scanner de transfert. Normaliser toutes les mesures quantitatives dans les fractions surnageantes et granulées à la protéine totale chargée.
Dans l’expérience de liaison saturante, tracer le pourcentage de protéines liées à la concentration d’amylopectine et ajuster les données à l’aide d’un logiciel d’analyse de données pour calculer la constante de dissociation, Kd.La capacité de liaison de SEX4 aux billes d’amylopectine ConA-sépharose a été analysée à l’aide de la page SDS. La présence de la protéine SEX4 dans la fraction granulée et de l’albumine sérique bovine dans la fraction surnageante a été notée. W278A, un mutant SEX4 connu avec une capacité de liaison au glucane significativement réduite, est apparu dans la fraction surnageante, indiquant l’utilité et la spécificité de ce test.
L’analyse Western blot a révélé une augmentation significative de la détection de SEX4 et la méthode est spécifique pour détecter les phosphates de glucane avec une étiquette histidine terminale terminale. Le test de cosédimentation a été testé à trois concentrations SEX4 différentes. Alors que deux microgrammes de SEX4 sont suffisants pour visualiser par détection par chimiluminescence, l’utilisation de cinq ou 10 microgrammes de SEX4 permet une détection plus précise.
En outre, une augmentation de la liaison SEX4 avec une concentration accrue d’amylopectine a été notée. L’affinité de liaison de l’amylopectine et de la protéine de type sauvage SEX4 à différentes concentrations a été déterminée et les données liées au pourcentage de protéines au modèle spécifique de liaison à un site ont donné un Kd d’environ 1,03 milligramme par millilitre. L’applicabilité de cette méthode pour mesurer la liaison de la laforine, du LSF2, du maïs SEX4 et de la pomme de terre SEX4 à l’amylopectine de pomme de terre a été évaluée.
Les résultats ont démontré que les protéines testées provenant de cultures importantes sur le plan agronomique sont également liées différemment à l’amylopectine. Il est crucial de se rappeler la normalisation de toutes les mesures quantitatives dans les fractions granulées et surnageantes à la protéine totale chargée. Pour vous assurer que toute l’amylopectine est liée aux billes, conservez les fractions surnageantes pour effectuer le test de glucose profond plus tard.
La phosphatase glucane est utilisée par des mécanismes distincts pour lier, localiser et déphosphoryler les glucides. Cette méthode permet d’explorer la liaison de la phosphatase glucane à différents domaines structuraux au sein de grands complexes polymères pour la déphosphorylation spécifique à la position.
