Этот анализ седиментации in vitro на основе конканавалина А предназначен для измерения аффинности связывания глюканфосфатаз с различными субстратами STA. Информация, которую мы получаем с помощью этого метода, имеет основополагающее значение для нашего понимания семейства ферментов глюканфосфатазы. Углеводные белковые взаимодействия относительно слабы, поэтому современные методы не могут обнаружить взаимодействия глюканфосфатазы и глюканов.
Наш анализ коседиментации на основе лектина может обнаруживать сродство связывания в миллимолярном диапазоне. Характеристика мутантов SEX4, а также других членов семейства ферментов глюканфосфатазы демонстрирует способность этого анализа количественно определять белково-углеводные взаимодействия. Одной из самых сложных частей анализа является оптимизация диапазона концентраций субстрата.
Мы рекомендуем начать с более широкого диапазона, чтобы получить представление, а затем сузить его до определенного диапазона. Для начала наберите пипеткой 250 микролитров суспензии шариков ConA-сефарозы в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра. Центрифугируйте содержимое при 10 000 г в течение 30 секунд при четырех градусах Цельсия.
После удаления надосадочной жидкости добавьте 750 микролитров связующего буфера в каждую пробирку, содержащую 250 микролитров шариков ConA-сефарозы. Центрифугируют пробирки при 10 000 G в течение одной минуты при четырех градусах Цельсия и удаляют надосадочную жидкость. Затем приготовьте двукратные разведения раствора солюбилизированного амилопектина, чтобы сделать серию из двух миллилитров разбавленных растворов амилопектина.
Чтобы приготовить шарики амилопектина ConA-сефарозы, добавьте 250 микролитров каждого разбавленного раствора амилопектина в пробирки, содержащие 250 микролитров шариков ConA-сефарозы, предварительно уравновешенных и связывающих буферов. Хорошо перемешайте содержимое и пометьте пробирки соответствующей концентрацией амилопектина. Инкубируйте содержимое пробирки на вращающемся колесе при четырех градусах Цельсия в течение 30 минут и центрифугируйте пробирки при 10 000 г в течение одной минуты.
Смешайте 250 микролитров шариков амилопектина ConA-сефарозы со 100 микролитрами связывающего буфера, содержащего 10 мкг крахмала с избытком четырех или белка SEX4, 10 миллимоляров дитиотреитола и 10 микромоляров коктейля ингибитора протеазы. Инкубируйте содержимое при четырех градусах Цельсия в течение 45 минут при осторожном вращении. Затем центрифугируйте пробирки при 10 000 г в течение одной минуты и осторожно пипетируйте 50 микролитров надосадочной жидкости в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра.
Добавьте 20 микролитров 4-кратного красителя страницы SDS и 10 микролитров дистиллированной воды в каждую пробирку, содержащую 50 микролитров собранных надосадочных фракций, и пометьте их как S. Аналогичным образом, добавьте 20 микролитров 4-кратного красителя страницы SDS и 80 микролитров дистиллированной воды в пробирки, содержащие промытые шарики ConA-сефарозы амилопектина SEX4. После добавления красителя и воды нагрейте все образцы при температуре 95 градусов Цельсия в течение 10 минут. После того, как шарики ConA-сефарозы амилопектина SEX4 центрифугированы при 10 000 G в течение одной минуты, сохраните надосадочную жидкость и пометьте ее как P. Загрузите 40 микролитров несвязанных образцов белка, помеченных как S, в лунки из 4-12% сборного полиакриламидного геля от самой низкой концентрации субстрата до самой высокой, оставляя первую полосу для маркера молекулярной массы белка.
Используйте второй гель для загрузки образцов белка, связанных с глюканом, помеченных P. Добавьте свежеприготовленный буфер SDS в обе камеры аппарата и запускайте гель при напряжении 150 вольт в течение 35 минут или до тех пор, пока передняя часть красителя не достигнет дна геля. Затем возьмите гелевую кассету из аппарата и снимите прокладки и стеклянные пластины, чтобы отделить гель для анализа вестерн-блоттинга. Сделайте один литр буфера для переноса, содержащего 5,8 грамма трис-основы, 2,9 грамма глицина, 0,37 грамма SDS и 200 миллилитров метанола.
Чтобы перенести разделенные по размеру белки из полиакриламидного геля на нитроцеллюлозную мембрану, соберите губки, фильтровальную бумагу, гель и нитроцеллюлозную мембрану в соответствии с западным протоколом переноса и работайте при напряжении 70 вольт в течение одного часа. После запуска геля инкубируют нитроцеллюлозную мембрану в белковом растворе от 1 до 5% бычьего сывороточного альбумина или молочного белка в 50 миллилитрах буфера TBST в течение одного часа, чтобы предотвратить неспецифическое связывание белка. Промойте мембрану три раза, используя буфер TBST, чтобы удалить несвязанный блокирующий раствор.
Затем инкубируйте мембрану в течение одного часа с разбавленным антителом, связанным с пероксидазой хрена, специфичным для белка, меченного гистидином. Затем трижды промойте мембрану в буфере TBST, чтобы удалить несвязанные антитела. Для цифровой визуализации сделайте раствор из равных частей хемилюминесцентных субстратных растворов, по 750 микролитров каждый в 1,5-миллилитровой пробирке, и инкубируйте мембрану в течение не менее пяти минут в растворе.
Поместите мембранный белок стороной вниз на сканер блоттинга и запустите программное обеспечение для сбора данных для количественного определения белка как в гранулированной, так и в надосадочной фракциях. Чтобы получить данные, начните количественные измерения сигнала с помощью программного обеспечения для сбора данных с помощью сканера блоттинга. Нормализуйте все количественные измерения в надосадочной и гранулированной фракциях к общему белковому нагруженному.
В эксперименте по насыщенному связыванию построите график зависимости процента связанного белка от концентрации амилопектина и сопоставьте данные с помощью программного обеспечения для анализа данных для расчета константы диссоциации Kd. Способность связывания SEX4 с шариками амилопектина ConA-сефарозы была проанализирована с использованием страницы SDS. Отмечено наличие белка SEX4 в гранулированной фракции и бычьего сывороточного альбумина в надосадочной фракции. W278A, известный мутант SEX4 со значительно сниженной способностью связывания глюканов, появился в надосадочной фракции, что указывает на полезность и специфичность этого анализа.
Вестерн-блоттинг-анализ выявил значительное увеличение обнаружения SEX4, и метод специфичен для обнаружения глюкановых фосфатов с концевой концевой гистидиновой меткой. Анализ коседиментации был протестирован при трех различных концентрациях SEX4. В то время как двух микрограммов SEX4 достаточно для визуализации с помощью хемилюминесцентного обнаружения, использование пяти или 10 микрограммов SEX4 позволяет более точно обнаружить.
Также было отмечено повышенное связывание SEX4 с повышенной концентрацией амилопектина. Было определено сродство связывания амилопектина и белка дикого типа SEX4 в разных концентрациях, а данные о процентном связывании белка с конкретной моделью связывания с одним сайтом дали Kd приблизительно 1,03 миллиграмма на миллилитр. Оценена применимость этого метода для измерения связывания лафорина, LSF2, кукурузного SEX4 и картофельного SEX4 с амилопектином картофеля.
Результаты показали, что испытуемые белки из агрономически важных культур также дифференциально связаны с амилопектином. Важно помнить о нормализации всех количественных измерений в гранулированных и надосадочных фракциях к общей белковой нагрузке. Чтобы убедиться, что весь амилопектин связан с шариками, сохраните надосадочные фракции для последующего глубокого анализа глюкозы.
Глюканфосфатаза использует различные механизмы для связывания, локализации и дефосфорилирования углеводов. Этот метод позволяет исследовать связывание глюканфосфатазы с различными структурными доменами в больших полимерных комплексах для позиционно-специфического дефосфорилирования.
