이 concanavalin A 기반 시험관 내 침강 분석은 다양한 STA 기질에 대한 글루칸 포스파타제의 결합 친화도를 측정하도록 설계되었습니다. 이 방법에서 얻은 정보는 글루칸 포스파타제 효소 계열을 이해하는 데 기본입니다. 탄수화물 단백질 상호작용은 상대적으로 약하기 때문에 현재의 방법으로는 글루칸 포스파타제와 글루칸 상호작용을 검출할 수 없습니다.
당사의 렉틴 기반 응고 분석은 밀리몰 범위의 결합 친화도를 감지할 수 있습니다. SEX4 돌연변이체와 글루칸 포스파타제 효소 계열의 다른 구성원의 특성화는 단백질 탄수화물 상호작용을 정량화하는 이 분석의 능력을 보여줍니다. 분석에서 가장 어려운 부분 중 하나는 기질의 농도 범위를 최적화하는 것입니다.
아이디어를 얻기 위해 더 넓은 범위로 시작한 다음 특정 범위로 좁히는 것이 좋습니다. 시작하려면 250마이크로리터의 ConA-세파로스 비드 현탁액을 1.5밀리리터 미세원심분리기 튜브에 피펫팅합니다. 섭씨 4도에서 30 초 동안 10, 000 G에서 내용물을 원심 분리합니다.
상청액을 버린 후, 750 마이크로리터의 결합 완충액을 250 마이크로리터의 ConA-세파로스 비드를 함유하는 각 튜브에 첨가한다. 튜브를 섭씨 4도에서 1 분 동안 10, 000 G에서 원심 분리하고 상청액을 제거합니다. 다음으로, 가용화된 아밀로펙틴 용액의 2배 희석액을 제조하여 일련의 2밀리리터 희석된 아밀로펙틴 용액을 만든다.
ConA-세파로스 아밀로펙틴 비드를 제조하기 위해, 250 마이크로리터의 ConA-세파로스 비드 사전 평형 및 결합 완충액을 함유하는 튜브에 각각의 희석된 아밀로펙틴 용액 250 마이크로리터를 첨가한다. 내용물을 잘 섞고 해당 아밀로펙틴 농도로 튜브에 라벨을 붙입니다. 튜브 내용물을 섭씨 4도에서 30 분 동안 회전하는 휠에서 배양하고 튜브를 10, 000 G에서 1 분 동안 원심 분리합니다.
250 마이크로리터의 ConA-세파로스 아밀로펙틴 비드를 10 마이크로그램의 전분 과잉 4 또는 SEX4 단백질, 10 밀리몰의 디티오트레이톨 및 10 마이크로몰의 프로테아제 억제제 칵테일을 함유하는 결합 완충액 100 마이크로리터와 혼합합니다. 내용물을 섭씨 4도에서 45분 동안 부드럽게 회전시키면서 배양합니다. 그런 다음 튜브를 10, 000G에서 1 분 동안 원심 분리하고 50 마이크로 리터의 상청액을 새로운 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브에 조심스럽게 피펫합니다.
수집 된 상청액 분획 50 마이크로 리터를 함유 한 각 튜브에 4X SDS 페이지 염료 20 마이크로 리터와 증류수 10 마이크로 리터를 추가하고 S.유사하게 20 마이크로 리터의 4X SDS 페이지 염료와 80 마이크로 리터의 증류수를 세척 된 ConA-sepharose amylopectin SEX4 비드가 들어있는 튜브에 첨가하십시오. 염료와 물을 첨가한 후 모든 샘플을 섭씨 95도에서 10분 동안 가열합니다. ConA-sepharose amylopectin SEX4 비드가 10, 000 G에서 1 분 동안 원심 분리되면 상청액을 저장하고 S로 표지 된 결합되지 않은 단백질 샘플의 P.Load 40 마이크로 리터를 가장 낮은 기질 농도에서 가장 높은 기질 농도에서 가장 높은 것까지 4-12 % 프리 캐스트 폴리 아크릴 아미드 젤 웰로 P.Load 라벨을 붙입니다.
두 번째 젤을 사용하여 P.Add 새로 준비된 SDS 페이지 실행 버퍼를 장치의 두 챔버에 넣고 150 볼트에서 35 분 동안 또는 염료 전면이 젤의 바닥에 도달 할 때까지 젤을 실행합니다. 그런 다음 장치에서 겔 카세트를 꺼내 스페이서와 유리판을 제거하여 웨스턴 블롯 분석을 위해 겔을 분리합니다. 트리스 염기 5.8g, 글리신 2.9g, SDS 0.37g 및 메탄올 200ml를 포함하는 1리터의 전달 완충액을 만듭니다.
폴리아크릴아미드 겔에서 니트로셀룰로오스 막으로 크기 분리된 단백질을 전달하기 위해 웨스턴 전달 프로토콜에 따라 스폰지, 여과지, 겔 및 니트로셀룰로오스 막을 조립하고 70볼트에서 1시간 동안 실행합니다. 겔을 실행한 후 니트로셀룰로오스 막을 1 내지 5%소 혈청 알부민 또는 우유 단백질의 단백질 용액에 50밀리리터의 TBST 완충액에 1시간 동안 배양하여 비특이적 단백질 결합을 방지한다. TBST 버퍼를 사용하여 멤브레인을 세 번 세척하여 결합되지 않은 차단 용액을 제거합니다.
다음으로, 히스티딘 태그가 붙은 단백질에 특이적으로 희석된 양고추냉이 퍼옥시다아제 연결 항체와 함께 1시간 동안 멤브레인을 배양한다. 그런 다음 멤브레인을 TBST 완충액으로 세 번 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거합니다. 디지털 이미징의 경우, 1.5 밀리리터 튜브에 각각 750 마이크로 리터의 화학 발광 기질 용액을 동일한 비율로 용액을 만들고 용액에서 최소 5 분 동안 멤브레인을 배양합니다.
멤브레인 단백질 면이 아래로 향하도록 블롯 스캐너에 놓고 수집 소프트웨어를 실행하여 펠릿 및 상청액 분획 모두에서 단백질을 정량화합니다. 데이터를 수집하려면 블롯 스캐너와 함께 수집 소프트웨어를 사용하여 정량적 신호 측정을 시작하십시오. 상층액 및 펠릿 분획의 모든 정량적 측정을 로드된 총 단백질로 정규화합니다.
포화 결합 실험에서, 결합 된 단백질 대 아밀로펙틴 농도의 백분율을 플롯하고 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터를 피팅하여 해리 상수를 계산하고, Kd.The SEX4의 결합 능력을 ConA-sepharose amylopectin beads에 SDS 페이지를 사용하여 분석했습니다. 펠렛 분획에서 SEX4 단백질의 존재와 상청액 분획에서 소 혈청 알부민의 존재가 주목되었다. 현저히 감소된 글루칸 결합 능력을 갖는 알려진 SEX4 돌연변이체인 W278A가 상청액 분획에 나타났으며, 이는 이 분석의 유용성과 특이성을 나타냅니다.
웨스턴 블랏팅 분석에서 SEX4 검출이 크게 증가한 것으로 나타났으며, 이 방법은 말단 히스티딘 태그로 글루칸 포스페이트를 검출하는 데 특이적입니다. cosedimentation 분석은 세 가지 다른 SEX4 농도에서 테스트되었습니다. 2마이크로그램의 SEX4는 화학발광 검출을 통해 시각화하기에 충분하지만, 5마이크로그램 또는 10마이크로그램의 SEX4를 사용하면 보다 정확한 검출이 가능합니다.
또한, 증가 된 아밀로펙틴 농도와 함께 증가 된 SEX4 결합이 주목되었다. 상이한 농도에서 아밀로펙틴 및 SEX4 야생형 단백질의 결합 친화도를 측정하고, 특정 부위 결합 모델에 결합된 단백질 퍼센트 데이터는 밀리리터당 대략 1.03 밀리그램의 Kd를 생성하였다. 감자 아밀로펙틴에 대한 라포린, LSF2, 옥수수 SEX4 및 감자 SEX4의 결합을 측정하기 위한 이 방법의 적용 가능성을 평가했습니다.
결과는 농업학적으로 중요한 작물에서 테스트된 단백질도 아밀로펙틴에 차별적으로 결합되어 있음을 입증했습니다. 펠릿 및 상청액 분획의 모든 정량적 측정을 로드된 총 단백질로 정규화하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 모든 아밀로펙틴이 비드에 결합되도록 하려면 상청액 분획을 저장하여 나중에 심포도당 분석을 수행합니다.
글루칸 포스파타제는 탄수화물을 결합하고, 위치를 파악하고, 탈인산화하는 뚜렷한 메커니즘을 사용합니다. 이 방법을 사용하면 위치 특이적 탈인산화를 위해 대형 고분자 복합체 내의 다양한 구조 도메인에 대한 글루칸 포스파타제의 결합을 탐색할 수 있습니다.
