使用封闭式半自动化工作流程进行临床应用的人间充质干细胞处理

台式离心是一个开放的手动过程，难以扩展。我们的实验方案展示了如何在单次运行中关闭和自动化间充质干细胞（MSC）的解离、洗涤和收获。设置很简单。

整个过程可以在cGMP类设施的生物安全柜外进行。封闭式自动化细胞处理可减少可能容易产生风险的手动处理步骤，并实现cGMP合规性。该方法可应用于在多层培养系统中扩增的其他细胞类型。

逆流离心系统允许针对不同应用修改任何方案步骤。展示这一程序的将是来自新加坡明星生物工艺技术研究所干细胞生物加工小组的科学家Alan Lam博士。要开始一次性逆流离心套件组件，请通过管焊接将一次性试剂盒与一次性PVC转移袋连接，如图所示。

然后，在生物安全柜内，将一个包含汇合物、沃顿氏果冻衍生的人间充质干细胞或沃顿氏果冻 HMSC 的 10 层多层烧瓶连接到定制管路组件上。将带有定制管组件的附加 10 层培养容器转移到工作台上，并将其焊接到一次性试剂盒的 E 线上。也。将无菌样品端口焊接到高流量一次性试剂盒的管路 G 上。

接下来，将收获线 H 连接到装有 50 毫升注射器的无菌诱饵上。要设置仪器运行，请使用仪器背面的拨动开关打开仪器，并使用提供的 USBC 电缆将笔记本电脑连接到仪器上的 USBC 端口。从桌面或开始菜单运行逆流离心机图形用户界面或 GUI 软件并登录。

然后，通过单击主欢迎页面上的"选择协议"按钮来加载协议。接下来，按下仪器上的蓝色解锁按钮并打开玻璃门，将组装好的一次性试剂盒装载到逆流离心系统上。首先将袋子按顺序悬挂在衣架挂钩上，使它们与气泡传感器条上的管口最好对齐，并将 10 层多层烧瓶成一定角度放置。

将套件与两个套件位置按钮对齐。拉伸蠕动泵周围的泵管，然后将白色灯泡形连接器压入到位。通过提起逆流离心室托架的银色杠杆并通过将杠杆返回到直立位置来固定离心室来连接离心室。

将管子从套件上的每个端口按入气泡传感器条的轨道中。按下门闩关闭门。打 启动 GUI 上的按钮。

将出现一个清单。前四项是仪器检查，后两项是用户检查。此时，请确保袋子和连接与套件图像匹配，并且手动夹具已打开。

按确认以显示协议输入屏幕。将数据输入或收获量对话框值设置为 45 毫升，然后按确认。按下仪器上的绿色启动按钮开始协议运行。

初始灌注完成后，确保将用过的介质完全泵入废物袋。在工作流程表中标记的暂停步骤中，向上提起多层烧瓶并摇动它，以将缓冲液均匀地分配到所有托盘上。完成后，将 10 层多层烧瓶放回其原始抽取位置以进行后续步骤。

在步骤20和23中，确保将胰蛋白酶消化的细胞完全转移到中间袋中。在步骤25中手动将中间袋充分混合。在步骤26中，使用两毫升诱饵注射器通过取样口取样。

在步骤29和30中，检查流化池床的稳定形成。它应该像这里显示的流化细胞床一样。运行在斜坡到停止步骤处完成，逆流离心系统上的所有夹紧值将自动关闭。

协议运行完成后，按下仪器上的蓝色解锁按钮并打开玻璃门。使用手提管封口机无菌密封收获线，并小心地将装满浓缩细胞收获的密封注射器转移到生物安全柜中进行细胞计数和冷冻保存。使用拉杆再次拆下腔室。

将灯泡连接器从配件中拉出，小心地将套件提起并丢弃到生物危害袋中。使用乙醇湿巾清洁仪器并关上门。最后，先关闭 GUI 应用程序，然后再关闭仪器背面的开关。

沃顿商学院果冻间充质干细胞在含血清和无血清、无异种培养基中扩增时均能很好地增殖。然而，在无血清、无异种培养基中的细胞表现出稍长的成纤维细胞样纺锤形形态，平均细胞大小更大，为17微米，而血清培养基中的细胞大小为15微米。在三种传代的两种培养基中，沃顿商学院果冻HMSC始终达到每平方厘米约23，000个细胞的最大细胞密度和34小时的群体倍增时间。

当沃顿商学院的果冻HMSC使用所展示的逆流离心在10层培养容器中扩增时，体积减少了10倍，产生的细胞浓度高达每毫升530万个细胞。该方案在三次独立运行中始终实现了约98%的高细胞回收率和约99%的高细胞活力。使用两种方法收获的沃顿果冻HMSC显示出CD73，CD90和CD105阳性以及CD34和CD45阴性的特征表面标志物谱。

与通过手动离心收获的细胞相比，从逆流离心中获得的细胞显示出相似的集落形成单位成纤维细胞测定或CFU电位。在这两种方法中，细胞都保留了分化为脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞的能力。逆流离心后细胞的细胞因子分泌谱与逆流前离心相当。

确保参考床设置组装一次性套件，将其置换在此逆流离心系统协议生成器中。用于洗涤最终产品残留杂质的方案可用于临床应用，以支持用户满足其批次放行标准。为了加快大规模处理的流体转移过程，可以使用外部泵首先将胰蛋白酶化的内容物转移到转移袋中，而不是直接从多层烧瓶中收获。