用化学发光法实时检测水稻免疫反应中活性氧的产生

该协议描述了一种优化的基于L-012的化学发光方法，可在水稻组织中的PANP诱导时实时检测ROS的产生。该方法简单、标准化，在严格控制的条件下具有高度可重复性。演示这个程序的是我实验室的博士生On Ying。

首先，用70%乙醇对去壳的水稻种子消毒一分钟，然后用40%次氯酸钠消毒一小时。用无菌水冲洗种子五次以去除余氯。在水稻鞘法中，用Murashige和Skoog或MS培养基直接将种子板在无菌玻璃容器中。

要将种子接种在叶盘法中，将它们铺在MS平板上五到七天，然后将它们移植到生长基质或土壤中。在具有12小时光照，12小时黑暗照片期的生长室中种植幼苗。在ROS测定前一天，用锋利的剃须刀片或手术刀片将10日龄水稻幼苗的鞘切成三毫米段进行预处理。

将五个鞘段放入含有 100 微升双蒸水的 96 孔微量滴定板的单个孔中 10 至 12 小时。使用带有柱塞的活检冲头从四到六周龄的水稻植株上切下叶盘。始终从主分蘖第二片叶子的中间三分之一处切下叶盘，以减少数据变化。

接下来，将一个叶盘放入含有 100 微升双蒸水的 96 孔微量滴定板的单个孔中 10 至 12 小时以进行预处理。将所有叶盘漂浮并朝上放在微量滴定板的孔中进行水预处理，以避免叶侧相关变化。通过混合9.4毫升50微摩尔Tris Hcl，400微升L012溶液，100微升马萝卜过氧化物酶和100微升Flg22制备启发溶液。

向孔中加入200微升启发溶液。启动软件并单击实验按钮以创建新协议或使用现有协议。单击弹出窗口中的程序以设置板并从要监测的板中选择孔。

单击“启动动力学”并将运行时间设置为 30 分钟或更长时间，具体取决于实验要求。选择最小间隔以尽可能频繁地获取读数。对于积分时间，根据信号强度选择一秒或更长时间。

单击验证，然后单击确定以确认设置，然后单击弹出窗口中的检测新板并等待软件提示加载板对话框。小心地从包含预处理组织的孔中取出双蒸水，避免任何组织损伤或干燥。使用多通道移液器将200微升的启发溶液添加到包含组织的孔中。

将要测试的板放在载体上并开始检测。为了通过Flg22诱导ROS，使用了叶盘和三毫米长的鞘。ROS 生成监控 35 分钟。

条形表示从五个技术重复计算的标准差的平均值。在水稻中，ROS产量的增加首先在1至2分钟内检测到，在10至12分钟达到峰值，并在约30至35分钟内恢复到基线。根据曲线计算ROS的总量。

要获得ROS值的总量，请将公式应用于相应的数据集，以计算每个时间间隔产生的ROS，可以通过应用公式总和来组合，以计算生成的总量。将叶盘的单孔或两半放入用100微升双蒸水预处理的96孔微量滴定板的孔中10至12小时，然后用Flg22处理以进行ROS诱导。两个半盘样品的读数值远高于整个叶盘的读数值。

平均而言，两个半盘样品的总值几乎是整个叶盘的1.6倍，这与边缘长度成正比，而不是与样品的面积成正比。这一结果支持ROS主要在伤口部位的细胞中产生。尝试此过程时，请轻柔地操作组织，不要进行额外的切口，这可能是数据变化的来源。

该方法可应用于植物组织中任何其他产生ROS的生理过程。