使用CRISPR SunTag-p65-HSF1激活系统研究米色脂肪生物学和代谢

该协议将SPH CRISPR激活系统作为传统病毒载体的替代策略，以在脂肪细胞中进行增益功能测定。它通过使用腺相关病毒递送定制的单向导 RNA 来允许在脂肪组织的复杂细胞环境中过表达单个或多个脂肪细胞内源性基因。该协议的挑战性步骤与克隆单向导RNA以及将腺相关病毒的产生和注射到脂肪组织中有关。

首先，使用chopchop或任何其他合适的工具设计用于CRISPR激活的单向导RNA或sgRNA。使用以下参数设计靶向PRDM16基因的sgRNA:使用CRISPR / Cas9靶向肌肉中的PRDM16和作为激活。向 sgRNA 添加突出部分以匹配载体骨架 PAAVU6GRNACBHM 樱桃中的 Sac1 限制性位点。

包括5'AGCT 3'，其中n对应于核苷酸。使用指示的工具获得 3'sgRNA 反向补体序列。接下来，对于单链互补寡核苷酸的退火，加入每5'和3'单链寡核苷酸各1微升，T4连接酶缓冲液1微升，T4多核苷酸激酶0.5微升和6.5微升水，最终反应体积为10微升。

使用热循环仪在 37 摄氏度下退火 30 分钟，在 95 摄氏度下退火 5 分钟，然后以每分钟 5 摄氏度的降温速率退火。然后，为了连接退火的sgRNA寡核苷酸，将25纳克质粒PAAVU6GRNACBHM樱桃加入到2微升退火的sgRNA寡核苷酸，1微升Sac1酶，2微升10X T4 DNA连接酶缓冲液，1微升T4 DNA连接酶和水中，最终反应体积为10微升。使用热循环仪，通过将反应混合物在 37 摄氏度下孵育 15 个循环 5 分钟，在 25 摄氏度下孵育 5 分钟，然后在 4 摄氏度下保持来进行连接。

接下来，通过42摄氏度的热休克45秒，用4微升的连接产物转化感受态大肠杆菌DH10B细胞，并铺展在含有每毫升氨苄青霉素10微克的琼脂平板上。使用PCR预混液通过菌落聚合酶链反应或PCR确认转化菌落，挑选菌落并将其与5微升预混液，0.1微升通用引物，0.1微升sgRNA逆转引物和5微升水混合。使用在 94 摄氏度下初始变性两分钟运行 PCR，然后在 94 摄氏度下变性 35 个循环 20 秒，在 60 摄氏度下退火 30 秒，在 72 摄氏度下延伸 30 秒，最后伸长步骤在 72 摄氏度下持续 5 分钟。

PCR后，使用琼脂糖凝胶电泳在0.5X TAE缓冲液中以90伏特分离30分钟。使用通用引物提交阳性样品进行桑格测序。接下来，按照制造商的说明使用质粒纯化试剂盒从阳性克隆中纯化质粒。

将麻醉小鼠置于仰卧位，并在髋关节近端的侧面剃除一小块区域，用于腹股沟白色脂肪组织或用剃须刀注射IWAT。加入脱毛膏五分钟。用水去除残留的乳霜，以避免皮肤灼伤。

用干净的纱布和70%酒精交替将聚维酮碘溶液涂抹在皮肤上，对皮肤进行三轮消毒。然后，在关节的近端区域用消毒剪刀做一个一到两厘米的切口，并使用镊子保持皮肤打开以露出脂肪库。WAT可以附着在两侧的皮肤上，从背部开始延伸到睾丸。

使用镊子，通过切口轻轻向上拉脂肪库，以确保注射处于正确的位置和深度。用2.5微升腺相关病毒或含有靶向内源性PRDM16基因的sgRNA的AAV填充微升注射器。小心地将针头以 30-45 度角插入 IWAT。

在组织的不同位置重复注射五次，以均匀地感染整个IWAT脂肪垫。将鼠标放在加热垫上，直到恢复意识。每 10 到 15 分钟监测一次动物，直到它完全康复。

动物恢复意识后，观察机车轮廓，它应该是线性的，没有痛苦或疼痛的迹象。将源自adipo SPH小鼠IWAT的基质血管细胞或SVF放入含有完整DMEM培养基的6孔板中一到两个小时，吸出培养基，使用PBS洗涤孔两次，并用新鲜的完全培养基替换。将细胞在37摄氏度，5%二氧化碳和95%湿度下孵育，直到细胞达到70-80%汇合。

在第0天，通过用诱导培养基处理细胞来诱导分化，两天后用维持培养基替换诱导培养基。两天后，在第四天，再次用新鲜的维护介质更换维护介质 2-3 天。每48小时更换一次维持培养基，直到前脂肪细胞完全分化为脂肪细胞。

使用光学显微镜观察成熟的脂肪细胞，因为分化的细胞似乎装有脂滴。在带有完整培养基的6孔培养板上生长细胞直至细胞达到70-80%汇合度后，将每微升携带AAV的sgRNA PRDM16的5.6 * 10^10病毒基因组与2毫升完全培养基和六二甲基溴混合。通过更换完整培养基并加入含有AAV的完整培养基来转导细胞。

将转导的细胞在37摄氏度95%湿度和5%二氧化碳下孵育12小时。按照描述的细胞分裂并观察细胞增殖和分化为米色脂肪细胞。来自脂肪SPH小鼠IWAT的免疫荧光图像显示了dCas9在对照组和PRDM16组中的表达。

SPH诱导的PRDM16表达明显诱导多眼米色脂肪细胞广泛积累到IWAT中。此外，定量PCR显示，与对照组相比，PRDM16组PRDM16和产热基因程序的表达增加。同样，体外基因表达分析证实，与对照组相比，PRDM16过表达组内源性PRDM16基因和产热基因的表达增加。

SPH诱导的PRDM16表达导致的基础和最大耗氧量高于对照细胞。重要的是，数据显示，与对照组相比，PRDM16组的无耦合呼吸增强。Adipo SPH模型适用于研究脂肪细胞内的多个基因和调控元件。

这种方法为更深入地了解米色脂肪生物学开辟了可能性。