通过免疫荧光测定 可视化 患者来源的卵巢癌类器官中的 DNA 损伤修复蛋白

DNA损伤反应的研究对于理解新型靶向治疗中卵巢癌潜在生物标志物的病理生理学是必要的。该技术允许样品保持完整，并允许检查抗原的作用位置。该方案快速，可以适应任何适合免疫荧光的抗原。

这种方法可以深入了解涉及化疗和PARP抑制剂耐药性的卵巢癌和DNA损伤修复过程。这些方法可以应用于涉及使用3D培养物和类器官的其他研究领域。首先，在不破坏3D基质的情况下从辐照和孵育的类器官中吸出培养基。

然后用300微升PBS清洗。将类器官固定在 300 微升 2% 多聚甲醛中 10 分钟。固定后，用300微升染色缓冲液洗涤类器官，并将其放在摇床上五分钟。

然后通过轻轻加入300微升透化缓冲液使类器官透化。孵育20分钟后，除去缓冲液并用300微升染色缓冲液洗涤。将类器官放在摇床上五分钟。

接下来，加入300微升染色缓冲液以阻断透化步骤。放在摇床上30分钟，然后用移液管吸出染色缓冲液。然后加入300微升在染色缓冲液中稀释的一抗。

在 4 摄氏度下孵育 16 小时。孵育后，取出一抗溶液。在摇床上用300微升染色缓冲液进行三次洗涤，每次洗涤5分钟。

加入300微升稀释在染色缓冲液中的二抗溶液，在黑暗中孵育一小时。一小时后，吸出二抗溶液并加入300微升稀释的DAPI。放在摇床上五分钟。

在摇床上用300微升染色缓冲液进行三次洗涤，每次洗涤5分钟。取出染色缓冲液，并使用腔室载玻片随附的去除套件拆下腔室。切下 P200 移液器吸头的尖端，并用它来添加封片剂以覆盖每个包含类器官标签的孔。

在标本上放置盖玻片，同时避免气泡。取透明指甲油并将其涂在盖玻片的侧面以密封载玻片。让它变硬一小时，然后将其置于 20 摄氏度。

使用共聚焦显微镜使用带有浸油的63X物镜获取图像。使用该协议，在照射前后对患者来源的卵巢癌类器官进行DNA损伤修复蛋白染色，并评估生物标志物，如γH2AX（DNA损伤标志物）和RAD51（同源重组修复标志物）。RPA（复制应激的标志物）、53BP1（非同源伴随的标志物）和Geminin（GS2期细胞周期标志物）也使用该技术进行了评估。

BME片倾向于解聚，因此在固定和吸出后密切注意至关重要。分析抗原以确定类器官损伤和DNA损伤反应的能力可以帮助评估化疗耐药性。