El estudio de la respuesta al daño del ADN es necesario para comprender la fisiopatología de los biomarcadores potenciales del cáncer de ovario en la nueva terapia dirigida. Esta técnica permite que la muestra permanezca intacta y permite el examen de antígenos en su lugar de acción. Este protocolo es rápido y se puede adaptar a cualquier antígeno susceptible de inmunofluorescencia.
Este método proporciona información sobre el cáncer de ovario y los procesos de reparación del daño del ADN involucrados en la resistencia quimioterapéutica y a los inhibidores de PARP. Estos métodos se pueden aplicar a otras áreas de estudio que implican el uso de cultivos 3D y organoides. Para empezar, aspire los medios de los organoides irradiados e incubados sin interrumpir la matriz 3D.
Luego lavar con 300 microlitros de PBS. Fijar los organoides en 300 microlitros de paraformaldehído al 2% durante 10 minutos. Después de la fijación, lave los organoides con 300 microlitros de tampón de tinción y colóquelos en una coctelera durante cinco minutos.
Luego permeabilice el organoide agregando suavemente 300 microlitros de tampón de permeabilización. Después de 20 minutos de incubación, retire el tampón y lave con 300 microlitros de tampón de tinción. Coloque los organoides en una coctelera durante cinco minutos.
A continuación, agregue 300 microlitros de tampón de tinción para bloquear el paso de permeabilización. Colocar en el agitador durante 30 minutos y aspirar el tampón de tinción con una pipeta. Luego agregue 300 microlitros de anticuerpos primarios diluidos en tampón de tinción.
Incubar a cuatro grados centígrados durante 16 horas. Después de la incubación, retire la solución primaria de anticuerpos. Realice tres lavados con 300 microlitros de tampón de tinción durante cinco minutos cada uno en la coctelera.
Agregue 300 microlitros de solución de anticuerpos secundarios diluidos en tampón de tinción e incube durante una hora en la oscuridad. Después de una hora, aspire la solución de anticuerpos secundarios y agregue 300 microlitros de DAPI diluido. Colocar en la coctelera durante cinco minutos.
Realice tres lavados con 300 microlitros de tampón de tinción durante cinco minutos cada uno en la coctelera. Retire el tampón de tinción y separe las cámaras utilizando el kit de extracción incluido con las guías de la cámara. Corte la punta de una pipeta P200 y utilícela para agregar medio de montaje para cubrir cada pocillo que contenga una lengüeta organoide.
Coloque un deslizamiento de cubierta sobre la muestra mientras evita las burbujas. Tome esmalte de uñas transparente y píntelo en los lados del vidrio de la cubierta para sellar el portaobjetos. Deja que se endurezca durante una hora y luego colócalo a 20 grados centígrados.
Adquiera imágenes utilizando un microscopio confocal utilizando un objetivo 63X con aceite de inmersión. Usando este protocolo, los organoides de cáncer de ovario derivados de pacientes se tiñeron para detectar proteínas de reparación del daño del ADN antes y después de la irradiación, y se evaluaron biomarcadores como gamma H2AX, un marcador de daño en el ADN, y RAD51, un marcador para la reparación de recombinación homóloga. RPA, un marcador de estrés de replicación, 53BP1, un marcador de unión no homóloga, y Geminin, un marcador del ciclo celular de fase GS2 también se evaluaron utilizando esta técnica.
Las pestañas BME tienden a despolimerizarse, por lo que prestar mucha atención después de la fijación y aspiración es vital. El análisis de los antígenos para determinar el daño de los organoides y la capacidad de montar una respuesta al daño del ADN podría ayudar en la evaluación de la resistencia quimioterapéutica.
