Изучение реакции на повреждение ДНК необходимо для понимания патофизиологии потенциальных биомаркеров рака яичников в новой таргетной терапии. Этот метод позволяет образцу оставаться неповрежденным и позволяет исследовать антигены в месте их действия. Этот протокол является быстрым и может быть адаптирован к любому антигену, поддающемуся иммунофлюоресценции.
Этот метод дает представление о раке яичников и процессах восстановления повреждений ДНК, связанных с химиотерапевтической резистентностью и устойчивостью к ингибиторам PARP. Эти методы могут быть применены к другим областям исследований, связанным с использованием 3D-культур и органоидов. Для начала аспирируйте среду из облученных и инкубированных органоидов, не нарушая 3D-матрицу.
Затем смойте 300 микролитрами PBS. Зафиксируйте органоиды в 300 микролитрах 2%-ного параформальдегида в течение 10 минут. После фиксации промойте органоиды 300 микролитрами окрашивающего буфера и поместите их на шейкер на пять минут.
Затем проникните органоид, аккуратно добавив 300 микролитров буфера пермеабилизации. После 20 минут инкубации снимите буфер и промойте 300 микролитрами окрашивающего буфера. Поместите органоиды в шейкер на пять минут.
Затем добавьте 300 микролитров буфера для окрашивания, чтобы заблокировать этап пермеабилизации. Поместите на шейкер на 30 минут и аспирируйте окрашивающий буфер с помощью пипетки. Затем добавьте 300 микролитров первичных антител, разведенных в окрашивающем буфере.
Инкубировать при четырех градусах Цельсия в течение 16 часов. После инкубации удаляют раствор первичных антител. Выполните три стирки с 300 микролитрами буфера для окрашивания в течение пяти минут каждая на шейкере.
Добавьте 300 микролитров раствора вторичных антител, разведенного в окрашивающем буфере, и выдерживайте в течение часа в темноте. Через час аспирируйте раствор вторичных антител и добавьте 300 микролитров разбавленного DAPI. Поставьте на шейкер на пять минут.
Выполните три стирки с 300 микролитрами буфера для окрашивания в течение пяти минут каждая на шейкере. Снимите буфер окрашивания и отсоедините камеры с помощью комплекта для удаления, входящего в комплект направляющих камеры. Отрежьте наконечник наконечника пипетки P200 и используйте его, чтобы добавить монтажную среду, чтобы покрыть каждую лунку, содержащую органоидный язычок.
Наденьте покров на образец, избегая пузырьков. Возьмите прозрачный лак для ногтей и нанесите его на боковые стороны покровного стекла, чтобы запечатать предметное стекло. Дайте ему затвердеть в течение часа, а затем поместите его при температуре 20 градусов по Цельсию.
Получение изображений с помощью конфокального микроскопа с использованием 63-кратного объектива с иммерсионным маслом. Используя этот протокол, органоиды рака яичников, полученные от пациентов, были окрашены на белки репарации повреждений ДНК до и после облучения и оценены на наличие биомаркеров, таких как гамма H2AX, маркер повреждения ДНК, и RAD51, маркер гомологичной рекомбинационной репарации. RPA, маркер репликационного стресса, 53BP1, маркер негомологичного предписания, и Geminin, маркер фазового клеточного цикла GS2, также оценивались с использованием этого метода.
Вкладки BME имеют тенденцию к деполимеризации, поэтому очень важно уделять пристальное внимание после фиксации и аспирации. Анализ антигенов для определения повреждения органоидов и способности генерировать реакцию на повреждение ДНК может помочь в оценке химиотерапевтической резистентности.
