DNA損傷応答の研究は、新しい標的療法における卵巣癌の潜在的なバイオマーカーの病態生理学を理解するために必要です。この技術により、サンプルを無傷のままにすることができ、抗原の作用位置での抗原の検査が可能になります。このプロトコルは迅速であり、免疫蛍光に適した任意の抗原に適合させることができます。
この方法は、化学療法およびPARP阻害剤耐性に関与する卵巣癌およびDNA損傷修復プロセスへの洞察を提供します。これらの方法は、3D培養およびオルガノイドの使用を含む他の研究分野に適用することができる。まず、照射およびインキュベートしたオルガノイドから培地を吸引し、3Dマトリックスを乱すことなく吸引します。
その後、300マイクロリットルのPBSで洗浄します。オルガノイドを300マイクロリットルの2%パラホルムアルデヒドに10分間固定します。固定後、オルガノイドを300マイクロリットルの染色バッファーで洗浄し、シェーカーに5分間置きます。
次いで、300マイクロリットルの透過処理バッファーを穏やかに添加してオルガノイドを透過処理する。20分間のインキュベーション後、バッファーを除去し、300マイクロリットルの染色バッファーで洗浄します。オルガノイドをシェーカーに5分間置きます。
次に、300マイクロリットルの染色バッファーを加えて、透過処理工程をブロックします。シェーカーに30分間置き、ピペットを使用して染色バッファーを吸引します。次に、染色バッファーで希釈した300マイクロリットルの一次抗体を追加します。
摂氏4度で16時間インキュベートします。インキュベーション後、一次抗体溶液を除去します。300マイクロリットルの染色バッファーで、シェーカー上でそれぞれ5分間3回洗浄します。
染色バッファーで希釈した二次抗体溶液300マイクロリットルを加え、暗所で1時間インキュベートします。1時間後、二次抗体溶液を吸引し、300マイクロリットルの希釈DAPIを加える。シェーカーに5分間置きます。
300マイクロリットルの染色バッファーで、シェーカー上でそれぞれ5分間3回洗浄します。染色バッファーを除去し、チャンバースライドに含まれている除去キットを使用してチャンバーを取り外します。P200ピペットチップのチップを切断し、これを使用して、オルガノイドタブを含む各ウェルを覆う封入剤を追加します。
気泡を避けながら、試験片の上にカバースリップを置きます。透明なマニキュアを取り、カバーガラスの側面にペイントしてスライドをシールします。1時間固めてから、摂氏20度に置きます。
共焦点顕微鏡で63倍の対物レンズと液浸オイルを使用して画像を取得します。このプロトコルを用いて、患者由来の卵巣癌オルガノイドを照射前後のDNA損傷修復タンパク質について染色し、DNA損傷のマーカーであるγH2AXや相同組換え修復のマーカーであるRAD51などのバイオマーカーを評価しました。複製ストレスのマーカーであるRPA、非相同結合のマーカーである53BP1、およびGS2期の細胞周期マーカーであるGemininもこの手法を使用して評価されました。
BMEタブは解重合する傾向があるため、固定および吸引後に細心の注意を払うことが重要です。抗原を分析してオルガノイドの損傷とDNA損傷応答を開始する能力を決定することは、化学療法耐性の評価に役立つ可能性があります。
