O estudo da resposta a danos no DNA é necessário para entender a fisiopatologia dos potenciais biomarcadores do câncer de ovário em novas terapias-alvo. Esta técnica permite que a amostra permaneça intacta e permite o exame de antígenos em seu local de ação. Este protocolo é rápido e pode ser adaptado a qualquer antígeno passível de imunofluorescência.
Este método fornece informações sobre o câncer de ovário e os processos de reparo de danos ao DNA envolvidos na resistência quimioterápica e inibidora de PARP. Esses métodos podem ser aplicados a outras áreas de estudo que envolvem o uso de culturas 3D e organoides. Para começar, aspirar o meio dos organoides irradiados e incubados sem interromper a matriz 3D.
Em seguida, lave com 300 microlitros de PBS. Fixe os organoides em 300 microlitros de paraformaldeído a 2% por 10 minutos. Após a fixação, lave os organoides com 300 microlitros de tampão de coloração e coloque-os em um agitador por cinco minutos.
Em seguida, permeabilize o organoide adicionando suavemente 300 microlitros de tampão de permeabilização. Após 20 minutos de incubação, retire o tampão e lave com 300 microlitros de tampão de coloração. Coloque os organoides em um agitador por cinco minutos.
Em seguida, adicione 300 microlitros de tampão de coloração para bloquear a etapa de permeabilização. Colocar no agitador durante 30 minutos e aspirar o tampão de coloração utilizando uma pipeta. Em seguida, adicione 300 microlitros de anticorpos primários diluídos em tampão de coloração.
Incubar a quatro graus Celsius por 16 horas. Após a incubação, remova a solução primária de anticorpos. Realize três lavagens com 300 microlitros de tampão de coloração por cinco minutos cada no agitador.
Adicione 300 microlitros de solução de anticorpos secundários diluída em tampão de coloração e incube por uma hora no escuro. Após uma hora, aspirar a solução de anticorpos secundários e adicionar 300 microlitros de DAPI diluído. Coloque no agitador por cinco minutos.
Realize três lavagens com 300 microlitros de tampão de coloração por cinco minutos cada no agitador. Remova o tampão de coloração e retire as câmaras usando o kit de remoção incluído com as lâminas da câmara. Corte a ponta de uma ponta de pipeta P200 e use-a para adicionar um meio de montagem para cobrir cada poço contendo uma aba organoide.
Coloque uma tampa deslize sobre o espécime, evitando bolhas. Pegue o esmalte transparente e pinte-o nas laterais do vidro da tampa para selar a lâmina. Deixe endurecer por uma hora e depois coloque-o a 20 graus Celsius.
Adquira imagens usando um microscópio confocal usando uma objetiva de 63X com óleo de imersão. Usando este protocolo, os organoides de câncer de ovário derivados da paciente foram corados para proteínas de reparo de danos ao DNA antes e após a irradiação, e avaliados para biomarcadores como gama H2AX, um marcador de dano ao DNA, e RAD51, um marcador para reparo de recombinação homóloga. RPA, um marcador de estresse de replicação, 53BP1, um marcador de junção não homóloga, e Geminin, um marcador de ciclo celular de fase GS2 também foram avaliados usando esta técnica.
As abas BME tendem a despolimerizar, portanto, prestar muita atenção após a fixação e aspiração é vital. Analisar os antígenos para determinar o dano organoide e a capacidade de montar uma resposta a danos no DNA pode ajudar na avaliação da resistência quimioterápica.
