Notch信号控制后生动物发育过程中硫酸盐的决定和模式。我们开发了一种抗体摄取测定法，用于标记缺口配体 delta-D 并成像其在发育中的斑马鱼前脑中径向胶质细胞祖细胞的内吞运输。斑马鱼隐藏式脑室注射使脑室内衬的强直径向胶质细胞祖细胞选择性吸收抗Dld-Atto-647N具有高效率和持久的效果。
该协议可以很容易地与在不同发育阶段使用的其他药理学或遗传扰动相结合，并可能适用于成人大脑以及人类多能干细胞衍生的2D或3D脑类器官。产生受精胚胎并孵育 18 到 20 小时后，将它们从培养箱中取出。首先使用白光在落射荧光显微镜下以20倍放大倍率观察它们。
使用玻璃移液管丢弃在显微镜下看起来混浊或破裂的死胚胎。然后打开荧光灯并选择显微镜的RFP滤光片设置。选择具有强烈红色荧光的胚胎，并将它们转移到装有蛋水的新培养皿中。
现在在白光下用两个细镊子手动去皮胚胎。用一对镊子握住绒毛膜，用其他镊子撕裂绒毛膜。用镊子小心地打开撕裂，并用其他镊子的尖端轻轻推动胚胎，使其足够大，使胚胎通过。
将去皮的胚胎转移到带有新鲜胚胎培养基的新培养皿中，以便在显微注射前快速冲洗。在拉拔器上拉动细注射针后，在立体解剖显微镜下用镊子打开针尖。使尖端的直径约为 10 微米，锥角约为 30 度。
现在将 0.5 微升抗 Dld 抗体与两微升抗小鼠 L G Atto-647N 抗体混合，移液 5 至 10 次以偶联它们并在室温下孵育至少 30 分钟。在孵育结束时，向抗体混合物中加入2.5微升封闭缓冲液和0.5微升0.5%酚红，并通过移液混合以封闭混合物中残留的任何未偶联抗体。接下来，在胚胎培养基中制备1%低熔点琼脂糖。
在 70 摄氏度下加热含有琼脂糖的混合物，直到混合物变成透明。等分琼脂糖溶液后，将它们保持在 40 摄氏度的加热块中。在含有1%低熔点琼脂糖的试管中冲洗胚胎三秒钟。
将胚胎放在带有单个琼脂糖滴的倒置塑料培养皿盖上，以分别安装每个胚胎。将胚胎横向放置在琼脂糖中并保持该位置，直到琼脂糖在室温下凝固。用蛋培养基覆盖琼脂糖中的所有镶嵌胚胎。
将嵌入的胚胎放在体视显微镜下，并用蛋水覆盖琼脂糖。用微型机械手设置气压注射器，将它们靠近显微镜。使用高压下含有气态氮气的钢制气瓶作为空气资源。
将胚胎安装在琼脂糖中后，打开气阀。在使用微量进样器的前填充模块时，将制备好的玻璃针头与两微升抗体混合物预先装入微量机械手上。现在将输入压力调整为每平方英寸 80 到 90 磅，将注射压力调整为每平方英寸 20 磅。
在显微镜下使用千分尺校准注射体积。根据针开口的大小将调谐持续时间设置为10到120毫秒。轻触桨以输送每个注射脉冲，并将每次输送的注射量调整为 4 到 5 纳升。
然后将微注射针的尖端戳穿后脑背顶板，向后至容地梅尔零一铰链点，在不撞击脑组织的情况下注射约10纳升抗体混合物。观察脑室中红色液体的流动。注射后，通过旋转微型机械手的旋钮迅速从胚胎中取出针尖。
为了成功注射，注射混合物的红色染料稳定地保留在脑室中，而不会泄漏到周围的琼脂糖中。将安装板移动到显微镜下，将另一个安装的胚胎定位在合适的位置进行重复。注射六到八个胚胎后，用显微手术刀剥开琼脂糖，将胚胎从嵌入的琼脂糖中释放出来。
将微注射的胚胎转移到装有30毫升胚胎培养基的新鲜培养皿中，并将其置于室温下进行下一步。30分钟后，将选定的胚胎转移到10毫升胚胎培养基中。为了安装胚胎，准备0.8%低熔点琼脂糖，在管中含有相同浓度的三烷。
使用玻璃移液管将注射的胚胎浸入温热的琼脂糖中三秒钟。然后立即用相同的玻璃移液管从琼脂糖中取出胚胎，并将胚胎放在35毫米玻璃底部培养皿的中心，从管中取出一滴琼脂糖。用纤维探针或加载尖端轻轻地定向胚胎，以保持胚胎大脑的背侧尽可能靠近玻璃底部。
轻轻转动胚胎位置以延长胚胎，而不会卷曲，因为琼脂糖逐渐凝固。然后，通过将玻璃底培养皿翻转过来检查胚胎位置。确保在显微镜下可以看到具有正确安装胚胎的整个背前脑。
加入两到三毫升含有三烷的28.5摄氏度预热胚胎培养基以覆盖胚胎。将培养皿正确放置在共聚焦显微镜的温度控制载物台上，并将成像室的温度调节到28.5摄氏度。胚胎现在已准备好进行成像。
注射Atto-647N的胚胎在脑室中显示出背景荧光。抗Dld-Atto-647N注射的斑马鱼胚胎在发育中的前脑的大多数细胞中显示出大量内化的荧光颗粒。延时成像显示细胞分裂过程中细胞内抗Dld-Atto-647N内体的运动。
大多数有丝分裂径向神经胶质细胞祖细胞显示抗Dld-Atto-647N内体的前部或后部不对称分离为两个子细胞。不对称性在后期结束时稳定下来，导致子细胞之后不对称地遗传了缺口信号内体。确保针头已放入正确的位置隐藏的品牌心室，并检查显微注射后是否有任何泄漏。
除了标记缺口δ信号传导外，如果细胞外结构域的良好抗体可用，该协议还适用于使用类似策略标记其他膜蛋白或细胞外蛋白。
