La signalisation Notch contrôle la décision et la structuration des sulfates pendant le développement chez les métazoaires. Nous avons développé un test d’absorption d’anticorps pour marquer le ligand delta-D de l’encoche et imager son trafic endocytaire dans les progéniteurs de la glie radiale dans le cerveau antérieur du poisson zèbre en développement. L’injection ventriculaire cérébrale cachée du poisson zèbre permet une absorption sélective de l’Anti-Dld-Atto-647N par les progéniteurs de la glie radiale myototique tapissant les ventricules cérébraux en développement avec une efficacité élevée et des effets durables.
Ce protocole peut être facilement combiné avec d’autres perturbations pharmacologiques ou génétiques utilisées à différents stades de développement et éventuellement adaptées au cerveau adulte ainsi qu’aux organoïdes cérébraux 2D ou 3D dérivés de cellules souches pluripotentes humaines. Après avoir généré les embryons fécondés et les avoir incubés pendant 18 à 20 heures, retirez-les de l’incubateur. Observez-les au microscope à épifluorescence en utilisant d’abord la lumière blanche à un grossissement de 20 fois.
Jetez les embryons morts qui semblent troubles ou rompus au microscope à l’aide d’une pipette en verre. Allumez ensuite la lampe fluorescente et choisissez le réglage du filtre RFP du microscope. Sélectionnez les embryons à forte fluorescence rouge et transférez-les dans un nouveau plat avec de l’eau d’œuf.
Maintenant, déchorionez les embryons manuellement avec deux pinces fines sous lumière blanche. Tenez le chorion avec une paire de forceps et faites une déchirure dans le chorion avec l’autre forceps. Ouvrez soigneusement la déchirure à l’aide de la pince et faites-la assez grande pour que l’embryon puisse passer à travers en poussant doucement l’embryon avec les extrémités des autres forceps.
Transférer les embryons déchorionés dans une nouvelle boîte de Petri avec un milieu embryonnaire frais pour un rinçage rapide avant la micro-injection. Après avoir tiré de fines aiguilles d’injection sur un tireur, ouvrez l’extrémité de l’aiguille avec une pince au microscope à dissection stéréoscopique. Faites le diamètre de la pointe autour de 10 micromètres et l’angle conique autour de 30 degrés.
Maintenant, mélangez 0,5 microlitre de l’anticorps anti-DLD avec deux microlitres de l’anticorps anti-souris L G Atto-647N en pipetant cinq à 10 fois pour les conjuguer et incuber à température ambiante pendant au moins 30 minutes. À la fin de l’incubation, ajouter 2,5 microlitres de tampon bloquant et 0,5 microlitre de rouge de phénol à 0,5% au mélange d’anticorps et mélanger par pipetage pour bloquer les anticorps non conjugués restant dans le mélange. Ensuite, préparez 1% de bas point de fusion agarose dans le milieu embryonnaire.
Chauffer le mélange contenant de l’agarose à 70 degrés Celsius jusqu’à ce que le mélange devienne transparent. Après avoir aliquote la solution d’agarose, conservez-les dans un bloc de chaleur à 40 degrés Celsius. Rincer l’embryon dans le tube contenant 1% d’agarose à bas point de fusion pendant trois secondes.
Placez l’embryon sur un couvercle de boîte de Petri en plastique inversé avec des gouttes d’agarose individuelles pour monter chaque embryon séparément. Posez les embryons à plat latéralement dans l’agarose et maintenez cette position jusqu’à ce que l’agarose se soit solidifiée à température ambiante. Couvrir tous les embryons montés dans l’agarose avec un milieu d’œuf.
Mettez les embryons incrustés sous le stéréomicroscope et couvrez l’agarose avec de l’eau d’œuf. Réglez l’injecteur de pression d’air avec des micro-manipulateurs, en les plaçant près des microscopes. Utilisez la bouteille de gaz en acier contenant de l’azote gazeux sous haute pression comme ressource d’air.
Une fois les embryons montés dans l’agarose, ouvrez la valve de gaz. Lors de l’utilisation du module de remplissage frontal du micro-injecteur, chargez l’aiguille en verre préparée avec deux microlitres de mélange d’anticorps sur le micromanipulateur. Maintenant, réglez la pression d’entrée à 80 à 90 livres par pouce carré et la pression d’injection à 20 livres par pouce carré.
Calibrer le volume d’injection à l’aide d’un micromètre au microscope. Réglez la durée de la mélodie en fonction de la taille de l’ouverture de l’aiguille de 10 à 120 millisecondes. Appuyez sur la palette pour délivrer chaque impulsion d’injection et réglez le volume d’injection de chaque livraison à quatre à cinq nanolitres.
Ensuite, enfoncez la pointe de l’aiguille de micro-injection à travers la plaque de toit dorsale du cerveau postérieur, postérieur au point charnière zéro-un du rondimere et injectez environ 10 nanolitres de mélange d’anticorps sans toucher le tissu cérébral. Observé l’écoulement des fluides rouges dans le ventricule cérébral. Après l’injection, retirez rapidement la pointe de l’aiguille de l’embryon en tournant le bouton du micromanipulateur.
Pour une injection réussie, le colorant rouge du mélange injecté reste dans le ventricule cérébral de manière stable sans fuite dans l’agarose entourée. Déplacez la plaque de montage sous le microscope pour localiser un autre embryon monté à une position appropriée pour les répétitions. Après avoir injecté six à huit embryons, pelez l’agarose avec un couteau microchirurgical pour libérer les embryons de l’agarose incrustée.
Transférer les embryons micro-injectés dans un plat frais avec 30 millilitres de milieu embryonnaire et les placer à température ambiante pour les étapes suivantes. Après 30 minutes, transférez les embryons sélectionnés dans 10 millilitres de milieu embryonnaire. Pour monter les embryons, préparez de l’agarose à point de fusion bas à 0,8% contenant la même concentration de tricane dans le tube.
Utilisez une pipette en verre pour immerger les embryons injectés dans l’agarose chaude pendant trois secondes. Ensuite, retirez immédiatement les embryons de l’agarose avec la même pipette en verre et placez les embryons au centre de boîtes de culture à fond de verre de 35 millimètres avec une goutte d’agarose du tube. Orientez doucement les embryons avec une sonde à fibres ou une pointe de chargement pour maintenir la face dorsale du cerveau embryonnaire aussi près que possible du fond de verre.
Tournez doucement la position de l’embryon pour étendre l’embryon sans se courber à mesure que l’agarose se solidifie progressivement. Ensuite, vérifiez la position de l’embryon en retournant le plat de fond en verre. Assurez-vous que tout le cerveau antérieur dorsal avec les embryons correctement montés peut être vu au microscope.
Ajouter deux à trois millilitres de milieu embryonnaire préchauffé à 28,5 degrés Celsius contenant du tricane pour couvrir l’embryon. Placez correctement l’antenne parabolique sur la platine à température contrôlée du microscope confocal et réglez la température de la chambre d’imagerie à 28,5 degrés Celsius. L’embryon est maintenant prêt pour l’imagerie.
Les embryons injectés Atto-647N ont montré une fluorescence de fond dans le ventricule cérébral. Les embryons de poisson-zèbre injectés anti-Dld-Atto-647N ont montré de grandes quantités de particules fluorescentes internalisées dans la plupart des cellules du cerveau antérieur en développement. L’imagerie accélérée a montré le mouvement des endosomes intracellulaires Anti-Dld-Atto-647N pendant la division cellulaire.
La plupart des progéniteurs de la glie radiale mitotique ont montré une ségrégation asymétrique antérieure ou postérieure des endosomes anti-Dld-Atto-647N en deux cellules filles. L’asymétrie s’est stabilisée vers la fin de l’anaphase, entraînant une hérédité asymétrique des endosomes de signalisation notch par les cellules filles par la suite. Assurez-vous que l’aiguille a été insérée dans le ventricule caché de la marque au bon endroit et vérifiez s’il y a une fuite après la micro-injection.
En plus du marquage de la signalisation delta notch, le protocole est applicable pour marquer d’autres protéines membranaires ou extracellulaires en utilisant des stratégies similaires, si un bon anticorps contre le domaine extracellulaire est disponible.
