A sinalização de entalhe controla a decisão e padronização do sulfato durante o desenvolvimento em metazoários. Desenvolvemos um ensaio de captação de anticorpos para marcar o ligante delta-D e obter imagens de seu tráfego endocítico em progenitores radiais da glia no prosencéfalo do peixe-zebra em desenvolvimento. A injeção ventricular oculta do peixe-zebra permite a captação seletiva de Anti-Dld-Atto-647N por progenitores da glia radial miotótica que revestem os ventrículos cerebrais em desenvolvimento com alta eficiência e efeitos duradouros.
Este protocolo pode ser facilmente combinado com outras perturbações farmacológicas ou genéticas utilizadas em diferentes estágios de desenvolvimento e possivelmente adaptadas ao cérebro adulto, bem como organoides cerebrais 2D ou 3D derivados de células-tronco pluripotentes humanas. Depois de gerar os embriões fertilizados e incubá-los por 18 a 20 horas, retire-os da incubadora. Observá-los sob um microscópio de epifluorescência usando luz branca primeiro a uma ampliação de 20 vezes.
Descarte embriões mortos que pareçam turvos ou rompidos ao microscópio usando uma pipeta de vidro. Em seguida, ligue a lâmpada fluorescente e escolha a configuração do filtro RFP do microscópio. Selecione os embriões com fluorescência vermelha forte e transfira-os para um novo prato com água de ovo.
Agora descorione os embriões manualmente com duas pinças finas sob luz branca. Segure o córion com um par de pinças e faça uma ruptura no córion com o outro fórceps. Abra a lágrima cuidadosamente usando a pinça e torne-a grande o suficiente para o embrião passar, empurrando suavemente o embrião com as pontas das outras pinças.
Transfira os embriões descorionados para uma nova placa de Petri com meio embrionário fresco para um rápido enxágue antes da microinjeção. Depois de puxar agulhas de injeção finas em um puxador, abra a ponta da agulha com pinça sob um microscópio de dissecção estéreo. Faça o diâmetro da ponta em torno de 10 micrômetros e o ângulo de conicidade em torno de 30 graus.
Agora misture 0,5 microlitros do anticorpo anti-Dld com dois microlitros do anticorpo anti camundongo L G Atto-647N, pipetando cinco a 10 vezes para conjugá-los e incubar à temperatura ambiente por pelo menos 30 minutos. Ao final da incubação, adicionar 2,5 microlitros de tampão bloqueador e 0,5 microlitros de vermelho de fenol 0,5% à mistura de anticorpos e misturar por pipetagem para bloquear quaisquer anticorpos não conjugados remanescentes na mistura. Em seguida, prepare a agarose de 1% de baixo ponto de fusão no meio embrionário.
Aqueça a mistura contida em agarose a 70 graus Celsius até que a mistura fique transparente. Depois de aliquotar a solução de agarose, mantenha-os em um bloco de calor a 40 graus Celsius. Enxaguar o embrião no tubo contendo agarose de 1% de baixo ponto de fusão durante três segundos.
Coloque o embrião em uma tampa de placa de Petri de plástico invertida com gotas individuais de agarose para montar cada embrião separadamente. Coloque os embriões lateralmente na agarose e mantenha esta posição até que a agarose se solidifique à temperatura ambiente. Cubra todos os embriões montados na agarose com meio de ovo.
Coloque os embriões embutidos sob o microscópio estéreo e cubra a agarose com água de ovo. Ajuste o injetor de pressão de ar com micro manipuladores, colocando-os próximos aos microscópios. Use o cilindro de gás de aço contendo nitrogênio gasoso sob alta pressão como recurso de ar.
Uma vez que os embriões tenham sido montados na agarose, abra a válvula de gás. Ao usar o módulo de enchimento frontal do microinjetor, faça o frontload da agulha de vidro preparada com dois microlitros de mistura de anticorpos no micromanipulador. Agora ajuste a pressão de entrada para 80 a 90 libras por polegada quadrada e a pressão de injeção para 20 libras por polegada quadrada.
Calibrar o volume de injeção usando um micrômetro sob o microscópio. Ajuste a duração do tempo de sintonia de acordo com o tamanho da abertura da agulha de 10 a 120 milissegundos. Toque na pá para entregar cada pulso de injeção e ajuste o volume de injeção de cada entrega para quatro a cinco nanolitros.
Em seguida, cutuque a ponta da agulha de microinjeção através da placa do teto dorsal do cérebro posterior, posterior ao ponto de dobradiça rondimere zero-one e injete cerca de 10 nanolitros de mistura de anticorpos sem atingir o tecido cerebral. Observado o fluxo de fluidos vermelhos no ventrículo cerebral. Após a injeção, remova a ponta da agulha do embrião rapidamente girando o botão do micromanipulador.
Para uma injeção bem-sucedida, o corante vermelho da mistura injetada permanece no ventrículo cerebral de forma estável sem vazar para a agarose cercada. Mova a placa de montagem sob o microscópio para localizar outro embrião montado em uma posição adequada para repetições. Depois de injetar seis a oito embriões, descasque a agarose com uma faca microcirúrgica para liberar os embriões da agarose incorporada.
Transfira os micro embriões injetados para um prato fresco com 30 mililitros de meio embrionário e coloque-os à temperatura ambiente para os próximos passos. Após 30 minutos, transferir os embriões selecionados para 10 mililitros de meio embrionário. Para montar os embriões, prepare agarose 0,8% de baixo ponto de fusão contendo a mesma concentração de tricane no tubo.
Use uma pipeta de vidro para imergir os embriões injetados na agarose quente por três segundos. Em seguida, remova imediatamente os embriões da agarose com a mesma pipeta de vidro e coloque os embriões no centro de placas de cultura de fundo de vidro de 35 milímetros com uma gota de agarose do tubo. Oriente os embriões suavemente com uma sonda de fibra ou ponta de carregamento para manter o lado dorsal do cérebro embrionário o mais próximo possível do fundo de vidro.
Vire a posição do embrião suavemente para estender o embrião sem enrolar à medida que a agarose se solidifica gradualmente. Depois, verifique a posição do embrião virando o prato de fundo de vidro. Certifique-se de que todo o prosencéfalo dorsal com os embriões corretamente montados possa ser visto ao microscópio.
Adicione dois a três mililitros de meio embrionário pré-aquecido de 28,5 graus Celsius contendo tricane para cobrir o embrião. Coloque a placa corretamente no estágio de temperatura controlada do microscópio confocal e ajuste a temperatura da câmara de imagem para 28,5 graus Celsius. O embrião já está pronto para exames de imagem.
Os embriões injetados com Atto-647N mostraram fluorescência de fundo no ventrículo cerebral. Os embriões de zebrafish injetados com anti-Dld-Atto-647N mostraram grandes quantidades de partículas fluorescentes internalizadas na maioria das células do prosencéfalo em desenvolvimento. Imagens de lapso de tempo mostraram o movimento de endossomos intracelulares Anti-Dld-Atto-647N durante a divisão celular.
A maioria dos progenitores mitóticos da glia radial mostrou segregação assimétrica anterior ou posterior dos endossomos anti-Dld-Atto-647N em duas células-filhas. A assimetria estabilizou-se no final da anáfase, resultando em herança assimétrica dos endossomos de sinalização de entalhe pelas células filhas posteriormente. Certifique-se de que a agulha foi colocada no ventrículo oculto da marca no local certo e verifique se há algum vazamento após a microinjeção.
Além da marcação da sinalização delta da incisura, o protocolo é aplicável para marcar outras proteínas de membrana ou proteínas extracelulares usando estratégias semelhantes, se um bom anticorpo para o domínio extracelular estiver disponível.
