איתות חריץ שולט בהחלטה ובתבניות סולפט במהלך ההתפתחות במטזואנים. פיתחנו בדיקת ספיגת נוגדנים לתיוג ליגנד החריץ דלתא-D והדמיית הסחר האנדוציטי שלו באבות גליה רדיאלית במוח הקדמי של דגי הזברה המתפתחים. הזרקת חדר המוח הנסתרת של דג הזברה מאפשרת ספיגה סלקטיבית של Anti-Dld-Atto-647N על ידי אבות גליה רדיאלית מיוטית המרפדת את חדרי המוח בהתפתחות ביעילות גבוהה ובהשפעות ארוכות טווח.
פרוטוקול זה יכול להיות משולב בקלות עם הפרעות פרמקולוגיות או גנטיות אחרות המשמשות בשלבי התפתחות שונים ואולי מותאם למוח הבוגר, כמו גם לאורגנואידים של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים שמקורם באורגנואידים דו-ממדיים או תלת-ממדיים של המוח. לאחר יצירת העוברים המופרים ודגירתם במשך 18 עד 20 שעות, הוציאו אותם מהאינקובטור. התבוננו בהם תחת מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי באמצעות אור לבן תחילה בהגדלה של פי 20.
השליכו עוברים מתים שנראים עכורים או קרועים מתחת למיקרוסקופ באמצעות פיפטה מזכוכית. לאחר מכן הפעל את מנורת הפלואורסצנט ובחר את הגדרת מסנן RFP של המיקרוסקופ. בחר את העוברים עם פלואורסצנטיות אדומה חזקה ולהעביר אותם לצלחת חדשה עם מי ביצה.
כעת יש לפרק את העוברים ידנית עם שני מלקחיים עדינים תחת אור לבן. החזיקו את הכוריון עם זוג מלקחיים אחד ועשו קרע בכוריון עם המלקחיים האחרים. פתחו את הקרע בזהירות בעזרת המלקחיים והפכו אותו לגדול מספיק כדי שהעובר יוכל לעבור דרכו על ידי דחיפה עדינה של העובר עם קצות המלקחיים האחרים.
העבירו את העוברים המפרקים לצלחת פטרי חדשה עם מדיום עוברי טרי לשטיפה מהירה לפני מיקרו-הזרקה. לאחר משיכת מחטי הזרקה עדינות על מושך, פתח את קצה המחט עם מלקחיים תחת מיקרוסקופ דיסקציה סטריאופונית. הפוך את הקוטר של קצה סביב 10 מיקרומטר ואת זווית taper סביב 30 מעלות.
עכשיו לערבב 0.5 מיקרוליטר של נוגדן נגד Dld עם שני מיקרוליטרים של נוגדן נגד עכבר L G Atto-647N על ידי pipeting חמש עד 10 פעמים כדי להצמיד אותם לדגור בטמפרטורת החדר לפחות 30 דקות. בסוף הדגירה מוסיפים 2.5 מיקרוליטר של חיץ חוסם ו-0.5 מיקרוליטר של 0.5% פנול אדום לתערובת הנוגדנים ומערבבים על ידי פיפטינג כדי לחסום נוגדנים לא מצומדים שנותרו בתערובת. לאחר מכן, להכין 1% נקודת התכה נמוכה agarose בתווך העובר.
מחממים את התערובת המכילה אגרוז ב-70 מעלות צלזיוס עד שהתערובת הופכת לשקופה. לאחר aliquotting תמיסת agarose, לשמור אותם בלוק חום ב 40 מעלות צלזיוס. שטפו את העובר בצינור המכיל 1% נקודת התכה נמוכה במשך שלוש שניות.
הניחו את העובר על מכסה צלחת פטרי מפלסטיק הפוך עם טיפות אגרוז בודדות כדי להרכיב כל עובר בנפרד. הניחו את העוברים שטוחים לרוחב באגרוז ושמרו על תנוחה זו עד שהאגרוז התמצק בטמפרטורת החדר. מכסים את כל העוברים הרכובים באגרוז עם מדיום ביצית.
הניחו את העוברים המשובצים מתחת למיקרוסקופ הסטריאו וכסו את האגרוז במי ביצה. הגדר את מזרק לחץ האוויר עם מיקרו מניפולטורים, הצבת אותם קרוב למיקרוסקופ. השתמש בבלון גז פלדה המכיל חנקן גזי בלחץ גבוה כמשאב האוויר.
לאחר שהעוברים הותקנו באגרוז, פתחו את שסתום הגז. בעת שימוש במודול המילוי הקדמי של מזרק המיקרו, טען את מחט הזכוכית המוכנה עם שני מיקרוליטרים של תערובת נוגדנים על מניפולטור המיקרו. כעת כוונן את לחץ הכניסה ל- 80 עד 90 פאונד לאינץ 'מרובע ואת לחץ ההזרקה ל- 20 פאונד לאינץ 'מרובע.
כיול נפח ההזרקה באמצעות מיקרומטר מתחת למיקרוסקופ. הגדר את משך זמן הכוונון בהתאם לגודל פתח המחט בין 10 ל -120 אלפיות השנייה. הקש על המשוט כדי לספק כל פעימת הזרקה וכוונן את נפח ההזרקה של כל משלוח לארבעה עד חמישה ננוליטר.
לאחר מכן יש לדחוף את קצה מחט המיקרו הזרקה דרך לוחית הגג הגבית של המוח האחורי, אחורית לנקודת הציר של רונדימיר אפס-אחד ולהזריק כ-10 ננוליטר של תערובת נוגדנים מבלי לפגוע ברקמת המוח. נצפתה זרימת נוזלים אדומים בחדר המוח. לאחר ההזרקה, הסר את קצה המחט מהעובר במהירות על ידי סיבוב הידית של מניפולטור המיקרו.
להזרקה מוצלחת, הצבע האדום של התערובת המוזרקת נשאר בחדר המוח ביציבות מבלי לדלוף לתוך האגרוז שמסביב. הזיזו את לוחית ההרכבה מתחת למיקרוסקופ כדי לאתר עובר רכוב אחר במיקום מתאים לחזרות. לאחר הזרקת שישה עד שמונה עוברים, מקלפים את האגרוז בסכין מיקרוכירורגית כדי לשחרר את העוברים מהאגרוז המשובץ.
מעבירים את העוברים המוזרקים במיקרו לצלחת טרייה עם 30 מיליליטר של מדיום עובר ומניחים אותם בטמפרטורת החדר לשלבים הבאים. לאחר 30 דקות, להעביר את העוברים שנבחרו 10 מיליליטר של מדיום העובר. כדי להרכיב את העוברים, הכינו אגרוז בעל נקודת התכה נמוכה של 0.8% המכיל ריכוז זהה של טריקן בצינור.
השתמשו בפיפטת זכוכית כדי לטבול את העוברים המוזרקים באגרוז החם למשך שלוש שניות. לאחר מכן מיד להסיר את העוברים מן agarose עם פיפטה זכוכית זהה ומניחים את העוברים במרכז של 35 מ"מ זכוכית תחתית צלחת צלחת עם טיפה של agarose מן הצינור. כוונו את העוברים בעדינות עם בדיקת סיבים או קצה העמסה כדי לשמור על הצד הגבי של המוח העוברי קרוב ככל האפשר לתחתית הזכוכית.
סובבו את תנוחת העובר בעדינות כדי להאריך את העובר מבלי להתכרבל כאשר האגרוז מתמצק בהדרגה. לאחר מכן, בדקו את מיקום העובר על ידי הפיכת צלחת תחתית הזכוכית. ודא כי כל המוח הקדמי הגבי עם עוברים רכובים כראוי ניתן לראות תחת המיקרוסקופ.
הוסף שניים עד שלושה מיליליטר של 28.5 מעלות צלזיוס שחומם מראש תווך עוברי המכיל טריקן כדי לכסות את העובר. הניחו את המנה כראוי על שלב מבוקר הטמפרטורה של המיקרוסקופ הקונפוקלי והתאימו את טמפרטורת תא ההדמיה ל -28.5 מעלות צלזיוס. העובר מוכן כעת להדמיה.
העוברים המוזרקים Atto-647N הראו פלואורסצנטיות רקע בחדר המוח. עוברי דגי הזברה שהוזרקו נגד Dld-Atto-647N הראו כמויות גדולות של חלקיקים פלואורסצנטיים מופנמים ברוב תאי המוח הקדמי המתפתח. הדמיית Time lapse הראתה תנועה של אנדוזומים תוך-תאיים Anti-Dld-Atto-647N במהלך חלוקת התא.
רוב אבות הגליה הרדיאלית המיטוטית הראו הפרדה אסימטרית קדמית או אחורית של אנדוזומים אנטי-Dld-Atto-647N לשני תאי בת. הא-סימטריה התייצבה לקראת סוף האנאפאזה, וכתוצאה מכך נוצרה תורשה אסימטרית של אנדוזומי איתות חריץ על ידי תאי הבת לאחר מכן. יש לוודא שהמחט הוכנסה לחדר המותג הנסתר במקום הנכון ולבדוק אם יש דליפה לאחר מיקרו-הזרקה.
בנוסף לתיוג איתות דלתא חריץ, הפרוטוקול ישים לתיוג חלבוני ממברנה אחרים או חלבונים חוץ-תאיים באמצעות אסטרטגיות דומות, אם קיים נוגדן טוב לתחום החוץ תאי.
